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云南省4種伊蚊的乙型腦炎病毒分離物的研究
張海林 施華芳 米竹青 自登云 龔正達侯宗柳 李兆祥 張云智 張嘉玉 楊蘭萍
摘 要 在云南省西南邊境9縣市捕獲伊蚊屬雌性成蚊16種19367只，用細胞法和乳鼠法分離病毒。從185批6491只白紋伊蚊中分離到病毒2株，從50批1605只剌擾伊蚊中分離到病毒2株，從23批772只窄翅伊蚊中分離到病毒2株，從4批103只阿薩姆伊蚊中分離到病毒1株。其它12種共10396只伊蚊的病毒分離物為陰性。分離到的7株病毒經(jīng)免疫熒光、酶免疫、血凝抑制和中和試驗鑒定，均為乙型腦炎病毒(JE virus)。白紋伊蚊是野外竹林的優(yōu)勢蚊種。分析認為白紋伊蚊在當?shù)匾倚湍X炎病毒保存和傳播中起重要作用，刺擾伊蚊、窄翅伊蚊和阿薩姆伊蚊亦可參與該病毒的傳播。
Isolation of Japanese Encephalitis Virus from Four Species of
Aedes Mosquito in Yunnan Province
Zhang Hailin Shi Huafang Mi Zhuqing Zi Dengyun Gong Zhengda
(Yunnan Provincial Institute of Epidemic Diseases Control and Research, Dali, Yunnan 671000)
Abstract A total of 19 367 adult female mosquitoes belonging to 16 species of Aedes genus were captured from nine countries, south-western part of Yunnan Province, China, and were examined by C6/36 cell method and suckling mouse method. Two strains of Japanese encephalitis (JE) virus were isolated from 6491 (185 pools) Aedes albopictus， two strains of JE virus were isolated from 1605 (50 pools) Ae. vexans,two strains of JE virus were isolated from 772 (23 pools) Ae. lineatopennis, and a strain of JE virus was isolated from 103 (4 pools) Ae. assamensis. Isolation of JE virus was negative to other 12 species of Aedes mosquitoes. Ae. albopictus was the superior species of mosquitoes in bamboo forest. These results indicated that Ae. albopictus from Yunnan has a potential role in the maintenance and transmission of JE virus in nature. Ae. vexans, Ae. lineatopennis and Ae. assamensis are also considered to be transmitting vector of JE virus in Yunnan.
Key words Mosquito, Aedes, Japanese encephalitis virus, Vector, Yunnan province
國內外在流行性乙型腦炎(簡稱乙腦)媒介研究中做了大量工作，明確了三帶喙庫蚊(Culex tritaeniorhynchus)是本病主要傳播媒介，一些庫蚊屬蚊蟲在乙腦病毒傳播中亦起重要作用。然而，伊蚊在本病傳播中的作用研究較少。為了解伊蚊屬蚊蟲自然感染乙腦病毒情況及媒介意義，我們在云南省西南部熱帶地區(qū)采集蚊蟲進行病毒分離，現(xiàn)將結果報告如下。
1 材料與方法
1.1 蚊蟲采集 在云南省景洪、勐臘、勐海、河口、孟連、耿馬、盈江、潞西和瑞麗9縣市的野外竹林和畜圈捕蚊，將蚊蟲置低溫凍死后分類編號，20～50只一批，放入小瓶內，液氮凍存待檢。
1.2 病毒分離 蚊蟲經(jīng)常規(guī)處理后，制成接種液，接種于C6/36細胞和乳鼠分離病毒。細胞出現(xiàn)規(guī)律病變或乳鼠發(fā)病即行鑒定。
1.3 病毒鑒定
1.3.1 抗體 乙腦病毒家兔免疫血清為本室自制；乙腦病毒單克隆抗體是中國預防醫(yī)學科學院病毒學研究所和中國藥品生物制品檢定所的制品；兔抗鼠熒光抗體和羊抗兔熒光抗體是北京生物制品研究所和蘭州生物制品研究所的制品；酶標SpA是中國預防醫(yī)學科學院流行病學微生物學研究所的制品。
1.3.2 抗原 乙腦病毒抗原為鼠腦蔗糖丙酮法抗原，本室制備。
1.3.3 免疫熒光試驗(IFAT) 采用間接法。感染細胞培養(yǎng)至第5天，將細胞吹下，滴于玻片，常規(guī)染色制片，用OLYMPUS熒光顯微鏡檢查。
1.3.4 細胞酶免疫(C-EIA)試驗 感染細胞培養(yǎng)于聚苯乙烯塑料板，至第5天，常規(guī)固定，加各種結合物及樣品，用目測法判定結果。方法詳見文獻[1]。
1.3.5 血凝(HA)及血凝抑制(HI)試驗 采用常規(guī)微量法。用0.5%鴿血球測定。血清用白陶土和鴿血球常規(guī)處理，抗原為4u。以50%的血球凝集被抑制為終點。
1.3.6 中和試驗 采用固定血清稀釋病毒法。用3～4周齡小白鼠測定，觀察14d，按Reed-Muench法計算中和指數(shù)。
2 結果
2.1 病毒分離
在上述9縣市共采獲伊蚊屬雌性成蚊16種19367只作病毒分離，從白紋伊蚊、剌擾伊蚊、窄翅伊蚊和阿薩姆伊蚊中分離出病毒7株(表1)。所獲毒株均能引起乳小白鼠或3周齡小白鼠發(fā)病和死亡，亦能導致C6/36細胞出現(xiàn)病變，并具有濾過性。
表1 從云南省4種伊蚊中分離乙腦病毒
Table 1 Isolation of Japanese encephalitis virus from four species of Aedes mosquitoes collected in Yunnan province
蚊種
Species of mosq. 采集地點
Collecting site 蚊蟲只數(shù)
No.of mosq. 批數(shù)
Pools of mosq. 陽性批數(shù)
No.of positive pools 病毒號及陽性蚊采集縣
Virus code and collecting counties of positive m
osq.
白紋伊蚊
Aedes albopictus 竹林Bamboo forest 6491 185 2 B88-81景洪Jinghong
D266瑞麗Ruili
剌擾伊蚊
Aedes vexans 竹林Bamboo forest
畜圈Stable 1194
411 38
12 2
0 B24-5景洪Jinghong
B86-17景洪Jinghong
窄翅伊蚊
Aedes lineatopennis 竹林Bamboo forest
畜圈Stable 76
696 3
20 1
1 D107盈江Yingjiang
B88-17景洪Jinghong
阿薩姆伊蚊
Aedes assamensis 竹林Bamboo forest 103 4 1 L99耿馬Gengma
其它12種伊蚊(偽白紋伊蚊 Ae. pseudalbopictus、圓斑伊蚊 Ae. annandalei、臺灣伊蚊 Ae. formosensis、顯著伊蚊 Ae. prominens、股點伊蚊模擬亞種 Ae. gardnerii imitator、白雪伊蚊 Ae. niveus、白盞伊蚊 Ae. alboscutellatus、環(huán)脛伊蚊 Ae. desmotes、側白伊蚊 Ae. albolateralis、白帶伊蚊米基爾亞種 Ae. albotaeniatus mikiranus、愛氏伊蚊 Ae. eldridgei和亞白紋伊蚊 Ae. subalbopictus)共10396只蚊蟲的病毒分離均為陰性。
2.2 病毒鑒定
2.2.1 免疫熒光試驗 分離到的7株病毒均與乙腦單克隆抗體或乙腦免疫血清出現(xiàn)特異性熒光反應(表2)。
2.2.2 細胞酶免疫試驗 B88-81、B86-17、B88-21和L99株均與乙腦單克隆抗體或乙腦免疫血清產生特異性酶免疫反應(表2)。
2.2.3 血凝特性 在pH6.4條件下，7株病毒的鼠腦蔗糖丙酮抗原均能與鴿血球出現(xiàn)凝集，滴度為1∶160～1∶5120之間(表2)。
2.2.4 血凝抑制試驗 所有分離株均能與乙腦病毒產生高滴度的抑制作用，抑制效價高達1∶320～1∶2560(表2)。
2.2.5 中和試驗 B88-81、B24-5、B86-17、B88-21和L99株對乙腦病毒的中和指數(shù)達到123～1000(表2)。
試驗證實，分離到的7株病毒均為乙腦病毒。
表2 分離自伊蚊的7株乙腦病毒的鑒定
Table 2 Identification of seven strains of Japanese encephalitis virus isolated from Aedes mosquitoes
毒株
Virus
strains C6/36細胞法
C6/36 cell method 乳鼠法
Sucking mouse method
細胞病變
CPE 免疫熒光
JE McAb
IFAT 細胞酶免疫
JE McAb
C-EIA 乳鼠發(fā)病死亡
Illness and death
of mice tested 血凝
HA 乙腦血抑
JE HI 對乙腦中和指數(shù)
Neu.index
to JE virus
B88-81 ? ? ? ＋ 320 640 794
D266 ? ? ND ＋ 1280 1280 ND
B24-5 ? ? ND ＋ 640 320 123
B86-17 ? ? ? ＋ 1280 640 1000
B88-21 ? ? ? ＋ 640 320 1000
D107 ? ? ND ＋ 160 640 ND
L99 ? ? ? + 5120 2560 354
ND： 未做(Not done)
2.3 4種伊蚊的分布特點
白紋伊蚊在本次調查的9縣市均有分布，其活動生態(tài)環(huán)境主要在居民點附近竹林和山坡竹林，畜圈和人房內幾乎不能捕到該蚊。白紋伊蚊在野外竹林區(qū)的構成比為30.46%(7429只/45種24387只)，屬優(yōu)勢或較優(yōu)勢種。
剌擾伊蚊僅在景洪、勐臘、耿馬和河口捕獲，主要分布于野外竹林，在該生境的構成比為12.71%(1194只/17種9394只)；在畜圈也有分布，構成比為1.26%(428只/20種33929只)。
窄翅伊蚊在景洪、耿馬、瑞麗和盈江的畜圈和野外竹林均有分布，畜圈的構成比為2.89%(696只/19種24060只)，野外竹林(耿馬)的構成比為2.75%(76只/24種2760只)，其數(shù)量較少。
阿薩姆伊蚊僅在耿馬和潞西的野外竹林捕到，構成比為2.21%(103只/24種4656只)，該蚊分布較為局限，且數(shù)量較少。
3 討論
白紋伊蚊在云南分布廣泛，尤其在本省西南部熱帶和鄰近熱帶的地區(qū)，是居民點附近竹林和山坡竹林區(qū)的主要蚊種之一。本次9個縣市調查，該蚊為野外竹林區(qū)的優(yōu)勢或較優(yōu)勢蚊種。白紋伊蚊分布與人居有一定關系，凡該蚊多的生境，均為靠近村寨的竹林、樹林。該蚊嗜血習性較廣，并有多次吸血的特性。國外研究表明，白紋伊蚊能感染、傳播和經(jīng)卵傳遞乙腦病毒［2～5］。本次從云南自然界白紋伊蚊中分離到乙腦病毒，并證明云南該蚊對乙腦病毒有較高的易感性，還能叮咬傳播和經(jīng)卵傳遞乙腦病毒［6，7］。白紋伊蚊在乙腦流行中可與庫蚊協(xié)同作用，是乙腦病毒重要媒介之一，在自然界乙腦病毒保存和傳播中起重要作用。
以往未見從剌擾伊蚊、窄翅伊蚊和阿薩姆伊蚊中分離到乙腦病毒的報道。這次從這3種伊蚊中分得乙腦病毒，表明它們可參與乙腦病毒的傳播。尤其是剌擾伊蚊和窄翅伊蚊，不僅分布于農村畜圈，在野外竹林也有分布，與人畜關系較為密切，具有重要的流行病學意義。
鑒于云南乙腦疫區(qū)分布較廣，加之自然地理條件較特殊，蚊蟲種類多，我們認為乙腦媒介亦較為復雜，有必要進行深入的研究。
* 云南省衛(wèi)生廳科研基金資助課題
作者單位：云南省流行病防治研究所，云南大理 671000
參考文獻
[1] 張海林，施華芳. C-ELISA與D-ELISA在乙腦和登革病毒快速檢測上的應用. 中國人獸共患病雜志，1988，4(2)：46～47
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[3] Rosen L, Roseboom L E, Gubler D J et al. Comparative susceptibi
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[6] 張海林，米竹青，張云智. 云南白紋伊蚊感染、傳播登革熱和乙型腦炎病毒的研究. 中國媒介生物學及控制雜志，1997，8(1)：50～53
[7] 張海林，米竹青，張云智. 白紋伊蚊垂直傳播乙型腦炎病毒的研究. 病毒學報，1996，12(1)：42～47
原作者： 張海林 施華芳 米竹青 自登云 龔正達
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