關(guān)鍵詞：豬鏈球菌  分離與鑒定

論文完成日期：2000年6月15日

目   錄

摘要………………………………………………1

前言………………………………………………2

1.                                 試驗(yàn)材料……………………………………….2

2.                                 方法…………………………………………….2

2.1病原分離……………………………………..2

2.2分離菌株的鑒定……………………………..2

2.3致病力及保護(hù)力試驗(yàn)………………………..3

2.4藥敏試驗(yàn)……………………………………..3

3.結(jié)果…………………………………………….4

3.                                 1分離菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征….………….4

3.2生化試驗(yàn)結(jié)果………………………………..5

3.3血清學(xué)鑒定結(jié)果……………………………..5

3.4致病力試驗(yàn)及保護(hù)力試驗(yàn)結(jié)果……………..5

3.5細(xì)菌回收試驗(yàn)結(jié)果…………………………..5

3.6藥敏試驗(yàn)結(jié)果………………………………..5

4分析與討論…………………………………….6

參考文獻(xiàn)…………………………………………7

豬鏈球菌的分離與鑒定

摘       要

2000年4月，陜西省岐山縣種豬繁育場(chǎng)仔豬流行關(guān)節(jié)炎和敗血癥。無(wú)菌采取患關(guān)節(jié)炎豬的關(guān)節(jié)液和患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結(jié)各8份病料，并對(duì)這16份病料進(jìn)行病原菌分離試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定、致病力試驗(yàn)、保護(hù)力試驗(yàn)、細(xì)菌回收試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明：該病原菌為2型豬鏈球菌，引起關(guān)節(jié)炎的豬鏈球菌較引起敗血癥的豬鏈球菌致病力弱；該菌對(duì)頭孢菌素、青霉素高度敏感。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌 分離鑒定

前        言

豬鏈球菌（Streptococcosis suis）是豬的一種重要疾病，養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家如美、英、荷及愛(ài)爾蘭等常有本病發(fā)生。我國(guó)于1958年就有豬鏈球菌病的報(bào)道，1976年我國(guó)南方幾省曾一度廣泛流行，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了很大危害。

豬鏈球菌截止到目前已發(fā)現(xiàn)的莢膜型已超過(guò)30種[1]。我國(guó)于1995年首例鑒定證實(shí)2型豬鏈球菌在我國(guó)的存在 [2]。豬鏈球菌可致2—6周齡仔豬敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎及支氣管肺炎等[3-7]。病豬和帶菌豬是本病的重要傳染源，病豬的鼻液、尿液、血液、肌肉、內(nèi)臟和關(guān)節(jié)內(nèi)均可檢出病原體。未經(jīng)無(wú)害處理的病死豬肉、內(nèi)臟及廢棄物是散播本病的重要原因，呼吸道是本病的主要傳播途徑。本病一年四季均可發(fā)生，但以4—10月份發(fā)生較多。本病常為地方性流行性，多呈敗血性。短期波及全群，如不進(jìn)行防治，則發(fā)病率、病死率很高，慢性常為地方性散發(fā)性傳染。

2000年4月，岐山縣種豬繁育場(chǎng)仔豬流行關(guān)節(jié)炎及敗血癥，多為2—6周齡仔豬。無(wú)菌采取關(guān)節(jié)炎病豬的關(guān)節(jié)液及敗血癥病豬的肝、脾、肺及腸系膜淋巴結(jié)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，證實(shí)為2型豬鏈球菌�，F(xiàn)將分離鑒定結(jié)果報(bào)告如下。

1．  實(shí)驗(yàn)材料

1．  1病料    無(wú)菌采取岐山縣種豬繁育場(chǎng)患關(guān)節(jié)炎病豬的關(guān)節(jié)液8份，編號(hào)為1—8號(hào)，無(wú)菌采取患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結(jié)8份，編號(hào)為9—16號(hào)。

1．  2試劑    試驗(yàn)所用的各種糖均購(gòu)自上海化學(xué)試劑二廠，批號(hào)自95—98年不等。

1．  3培養(yǎng)基    綿羊鮮血平板、匹克氏增菌液、10ml/L豬血清肉湯及各種糖培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備[8]。

1．  4血清學(xué)試驗(yàn)     豬鏈球菌診斷血清與平板凝集抗原均購(gòu)自中國(guó)獸藥鑒察所，批號(hào)為990705。

1． 5藥敏紙片    購(gòu)自浙江省軍區(qū)后勤部，批號(hào)20000312。

1．  6試驗(yàn)動(dòng)物    健康小白鼠（30—35g）50只，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2． 方法  

2．  1  病原分離

    將所采病料分別涂片，革蘭氏染色鏡檢，然后，分別接種鮮血瓊脂平板。37℃需氧培養(yǎng)24h后，挑取可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37℃培養(yǎng)24h后，革蘭氏染色，顯微鏡檢查，再接種血清肉湯，純化后放置4℃，冷藏備用。

2．2  分離菌株的鑒定

2．2．1生化試驗(yàn)

    隨機(jī)抽取上述分離菌血清肉湯培養(yǎng)物3#、8#、13#、15#，分別接種于蔗糖、山梨醇、棉實(shí)糖、葡萄糖、甘露糖、蕈糖、乳糖、菊糖、水楊苷、馬尿酸鈉培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后，觀察其對(duì)糖的利用情況。

2．2．2血清學(xué)鑒定

    將3#、8#、13#、15#菌經(jīng)緩沖肉湯培養(yǎng)8h，通過(guò)3000r/min離心10min，PBS洗滌2次，用Ph7.2 的0.01mol/L PBS制成    1*10 10~2*10 10細(xì)菌懸液。取1滴上述細(xì)菌懸液與適當(dāng)?shù)目寡�清在潔凈玻片上混勻，立即觀察凝集現(xiàn)象。同時(shí)，設(shè)立細(xì)菌懸液對(duì)照及血清對(duì)照。

2．3 致病力及保護(hù)力試驗(yàn)

2．3．1菌落形成單位的測(cè)定  按常規(guī)方法進(jìn)行[9]

2．3．2致病力試驗(yàn)

無(wú)菌吸取上述血清肉湯培養(yǎng)物 （含菌量5.0*10 8CFU/ml）以0.1ml /只、0.2ml/只、 0.3ml/只、 0.4ml /只、0.5ml/只分別腹腔注射小白鼠2只，觀察其死亡時(shí)間和數(shù)量，測(cè)定其最小致死量。再將上述血清肉湯培養(yǎng)物腹腔注射小白鼠，小白鼠共14只，分7 組。第一組，每只小白鼠注射3#菌0.2ml，第二組每只注射8#菌0.2ml，第三組每只注射3#、8#菌各0.1ml，第四組每只注射13#菌0.2ml，第五組每只注射15#菌0.2ml，第六組每只注射13#、15#菌各0.1ml，第七組每只注射無(wú)菌血清肉湯1.0ml。以上各組分別飼養(yǎng)觀察其死亡時(shí)間及數(shù)量。

2．3．3保護(hù)力試驗(yàn)

    將3#、8#、13#、15#血清肉湯培養(yǎng)物分別接種于18  cm鮮血平板。37℃培養(yǎng)24h后，收菌，用麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔�適當(dāng)稀釋，然后用0.3%甲醛滅活；37℃作用24h；作無(wú)菌檢驗(yàn)。然后分別腹部皮下接種小白鼠2只，0.4ml/ 只。10天后，再分別人工感染，0.2ml/只。

2．3．4細(xì)菌回收試驗(yàn)

    對(duì)致病力試驗(yàn)出現(xiàn)癥狀及死亡小白鼠剖檢，并采集病料，進(jìn)行分離。

2．4藥敏試驗(yàn) 

    采用紙片擴(kuò)散法，用無(wú)菌棉簽蘸取分離菌的血清肉湯培養(yǎng)物，均勻涂布于9cm鮮血平板；待稍干后，用無(wú)菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼在培養(yǎng)基表面，4℃2h使藥物擴(kuò)散，然后置37℃培養(yǎng)20—24h，觀察結(jié)果。結(jié)果按抑菌圈直徑大小和各抗菌藥的具體標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)定為高度敏感、中度敏感或耐藥。結(jié)果評(píng)定參照表1。

表 1    各種抗菌藥物的抑菌圈與敏感標(biāo)準(zhǔn)

抗菌藥物名稱
 抑菌圈直徑（mm）
 
耐藥
 中度敏感
 高度敏感
 
青霉素

土霉素

潔霉素

鏈霉素

慶大霉素

卡那霉素

頭孢菌素
 <10

<10

<10

<10

<12

<12

<10
 10~12

10~14

10~14

10~14

13~14

13~14

10~15
 >13

>15

>15

>15

>15

>15

>15
 

3．結(jié)果

3．1分離細(xì)菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征

3．1．1培養(yǎng)特性

    37℃培養(yǎng)24h后，所采的12份病料在鮮血瓊脂平板上形成表面光滑、隆起的灰綠色小菌落，外層有明顯的β溶血環(huán)。該菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉湯中先均勻渾濁，后在試管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。

3．1．2染色特性  

    關(guān)節(jié)液、鮮血瓊脂、匹克氏增菌液及血清肉湯培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查為革蘭氏陽(yáng)性，在關(guān)節(jié)液、鮮血瓊脂培養(yǎng)物中多呈單個(gè)、雙球或短鏈狀排列，在匹克氏增菌液及血清肉湯培養(yǎng)物中多呈長(zhǎng)鏈狀。

3．2生化試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表2）

        表2    分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

鑒定  蔗糖 山梨 棉實(shí) 葡萄 甘露  蕈糖 乳糖 菊糖 水楊 馬尿

項(xiàng)目        醇   糖   糖   糖                   苷  酸鈉
 
3#     +    -    -    +     +     +    +    +    +    -

8#     +    -    -    +     +     +    +    +    +    -

13#    +    -    -    +     +     +    +    +    +    -

15#    +    -    -    +     +     +    +    +    +    -
 

    判定標(biāo)準(zhǔn)：“+”表示大多數(shù)（90%—100%）菌株為陽(yáng)性；“-”表示大多數(shù)（90%—100%）菌株為陰性。

    表2表明分離的3#、8#、13#、15#菌的生化反應(yīng)結(jié)果均符合豬鏈球菌的生化特性，說(shuō)明分離的菌均為豬鏈球菌。

3．3 血清學(xué)鑒定結(jié)果

將3#、8#、13#、15#細(xì)菌懸液與1/2及2型抗血清混合，立即可見(jiàn)明顯的凝集現(xiàn)象，但不與1型及其他型抗血清出現(xiàn)凝集。直接挑取細(xì)菌菌落與血清混勻，也能得到一致結(jié)果。陰性對(duì)照均未見(jiàn)凝集現(xiàn)象。

3．4 致病力試驗(yàn)結(jié)果及保護(hù)力試驗(yàn)結(jié)果

3．4．1致病力試驗(yàn)結(jié)果

第一組、第二組小白鼠注射血清肉湯培養(yǎng)物48h內(nèi)均未見(jiàn)死亡，第三組48h內(nèi)有一只死亡，第四組、第五組、第六組在注射血清肉湯培養(yǎng)物18h內(nèi)全部死亡。死亡后，小白鼠皮膚發(fā)紺，剖檢肝、脾、肺、心出血，呈敗血癥。第七組健活。由于第一、二、三組死亡數(shù)量非常少，所以，再用相同劑量分別背部皮下接種小白鼠各2只，48h后處死，剖檢發(fā)現(xiàn)注射部位有直徑0.9~1.1cm的膿腫，濃汁呈黃綠色。

3．4．2保護(hù)力試驗(yàn)結(jié)果  免疫的小白鼠再經(jīng)攻毒后均未發(fā)病。

3．5細(xì)菌回收試驗(yàn)結(jié)果

將上述死亡及發(fā)病的小白鼠剖檢采集病料，進(jìn)行細(xì)菌分離、生化試驗(yàn)及血清學(xué)鑒定，能得到原分離菌。

3．6藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

菌號(hào)
 抑菌環(huán)直徑（mm）
 
頭孢菌素 青霉素 潔霉素 卡那霉素 土霉素 鏈霉素 慶大霉素
 
 3#      19      15    14      13      8     7      7

 8#      18      16    13      13      8     6      7

 13#     19      16    14      13      7     7      8

 15#     19      15    13      14      8     8      8

 平均值  18.75    15.5   13.5     13.25    7.75    7.0     7.5
 

    表3表明，結(jié)果敏感的藥物依次是：頭孢菌素、青霉素；中度敏感的依次是：潔霉素和卡那霉素；而對(duì)土霉素、鏈霉素、慶大霉素具有抗藥性。

4．分析與討論

 4．1   豬鏈球菌（Streptoccus suts）是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要病原菌。80年代初，加拿大由豬鏈球菌引起的疾病開(kāi)始增加。那時(shí)僅檢出9種夾膜血清型，其中2型是最常見(jiàn)的。

 4．2   豬鏈球菌病在臨床上有敗血型、腦膜腦炎型、關(guān)節(jié)炎型支氣管炎型等。過(guò)去屢有敗血型豬鏈球菌的報(bào)道，而關(guān)于集約化養(yǎng)豬場(chǎng)關(guān)節(jié)炎型鏈球菌病的報(bào)道較少。本次試驗(yàn)從患關(guān)節(jié)炎豬的關(guān)節(jié)液中成功的分離出了豬鏈球菌。另外，岐山種豬場(chǎng)，約有60%的仔豬流行關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重者可發(fā)生敗血癥而死亡，給種豬場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。所以，研究本病可為生產(chǎn)中防制本病提供理論依據(jù)。

 4．3   病豬和帶菌豬是本病的重要傳染源。病豬的鼻液、尿液、肌肉、內(nèi)臟和關(guān)節(jié)內(nèi)均帶有病原體，所以，我們建議，首先應(yīng)加強(qiáng)對(duì)健康豬的免疫。另一方面，在發(fā)病后，加強(qiáng)病豬和健康豬的隔離，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室所做的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，配合藥物治療，建議用頭孢菌素、青霉素、潔霉素等藥物治療。岐山縣種豬繁育場(chǎng)采納我們的建議后，首先對(duì)所有的未發(fā)病仔豬用滅活疫苗免疫接種，對(duì)已發(fā)病的豬用青霉素等藥物配合治療。另外，注意衛(wèi)生管理。目前該病已得到有效的控制。

 4．4   從致病力試驗(yàn)結(jié)果可以看出，引起豬關(guān)節(jié)炎的豬鏈球菌的致病力較小，而引起敗血癥的豬鏈球菌的致病力較強(qiáng)。但通過(guò)生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定，它們又是同種細(xì)菌且血清型也相同。為什么同種血清型的豬鏈球菌的致病力差別很大？這個(gè)問(wèn)題還有待于進(jìn)一步研究。

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