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血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及發(fā)病機(jī)制
血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及發(fā)病機(jī)制作者：姜彩肖 張麗梅 杭景仙
【摘要】 目的 研究血管性癡呆（VD）大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及發(fā)病機(jī)制。方法 4血管阻斷法制作模型，Morris水迷宮法檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化法觀察Bcl?2和Bax表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，亞甲藍(lán)比色法檢測(cè)血清中H2S含量。結(jié)果 模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退。Bcl?2/Bax在缺血再灌注（I/R）開(kāi)始時(shí)升高，隨后開(kāi)始下降。模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加。模型組大鼠血清中H2S含量明顯減少。血清H2S含量與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率間呈明顯負(fù)相關(guān)。 結(jié)論 VD可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和血清中H2S含量減少；海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度可能與內(nèi)源性H2S生成減少有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 血管性癡呆；學(xué)習(xí)記憶；免疫組化；流式細(xì)胞術(shù)；硫化氫
血管性癡呆（VD）是老年期癡呆的主要類(lèi)型之一，它是由一系列腦血管因素（缺血、出血、急慢性缺氧性腦血管病等）導(dǎo)致腦組織損害引起的以認(rèn)知功能障礙為特征的癡呆綜合征〔1〕，不僅給病人帶來(lái)長(zhǎng)期痛苦，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，而且給家庭、社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)，因此研究VD的發(fā)病機(jī)制以指導(dǎo)其防治具有很高的社會(huì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。H2S是第三類(lèi)氣體信號(hào)分子，廣泛參與機(jī)體的多種生理和病理過(guò)程，為進(jìn)一步了解其在VD發(fā)病中的作用，本研究觀察大腦缺血/再灌注（I/R）不同時(shí)間對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響、血清中H2S含量改變及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，從行為學(xué)、細(xì)胞凋亡及內(nèi)源性H2S表達(dá)量及其相互關(guān)系等方面，探討VD的發(fā)病機(jī)制，為其防治提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 動(dòng)物與分組 健康Wistar雄性大鼠64只，體重300——350 g（由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分為8組，正常組，假手術(shù)組和VD模型組，VD模型組又分為大腦I/R 2,8,24,72,168和720 h組，每組8只動(dòng)物。
1.2 動(dòng)物模型制備 4血管阻斷法（4?VO法）〔2〕建立VD大鼠模型。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過(guò)程與VD模型組相同，但不電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈，不阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈。術(shù)后按再灌注的不同時(shí)間分別將動(dòng)物處死，經(jīng)主動(dòng)脈依次灌注生理鹽水100 ml和4%多聚甲醛500 ml,取出腦組織，石蠟包埋切片，用于免疫組化顯示Bcl?2、Bax及蘇木素?伊紅（HE）染色。
1.3 學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)定 Morris水迷宮檢測(cè)〔3〕：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始于VD術(shù)后4 w,預(yù)先將迷宮任意分為4個(gè)象限。平臺(tái)放入上述4個(gè)象限中隨機(jī)選擇的1個(gè)象限中，在大鼠游泳池邊標(biāo)記4點(diǎn)作為大鼠的入水點(diǎn)，記錄120 s內(nèi)大鼠從入水到爬上平臺(tái)所需的時(shí)間，即逃避潛伏期。記錄各組大鼠的逃避潛伏期，作為學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)指標(biāo)。
1.4 取材 大鼠10%水合氯醛（3 ml/kg體重）腹腔注射麻醉后，快速開(kāi)胸暴露心臟，心尖取血4——5 ml,分離血清，用于血清H2S含量測(cè)定；然后斷頭處死，并立即在冰臺(tái)上開(kāi)顱，迅速分離大鼠海馬，用70%酒精固定，4℃冰箱保存過(guò)夜，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。
1.5 HE染色 切片常規(guī)脫蠟至水→1%鹽酸酒精分化→伊紅染色2 min→切片常規(guī)梯度酒精脫水→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→中性樹(shù)膠封固。
1.6 免疫組化染色（SP法） Bax兔抗鼠多克隆抗體，Bcl?2兔抗鼠多克隆抗體（Santa Cruz公司生產(chǎn)）。
1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 采用美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics?XL Ⅱ型流式細(xì)胞儀。
1.8 血清中H2S含量的檢測(cè) 亞甲藍(lán)分光光度法。
1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。
2 結(jié) 果
2.1 學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)結(jié)果 各組大鼠在迷宮各入水點(diǎn)搜索平臺(tái)的結(jié)果見(jiàn)表1,隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組大鼠的逃避潛伏期均縮短，第2天I/R 720 h組與正常組和假手術(shù)組比較逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.01）；正常組和假手術(shù)組逃避潛伏期差異不顯著（P>0.05）。
2.2 VD大鼠病理形態(tài)學(xué)結(jié)果 HE染色后，神經(jīng)細(xì)胞胞漿呈淡紅色，核呈藍(lán)黑色。假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、密集，細(xì)胞完整，結(jié)構(gòu)正常，胞漿豐富，膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)增生；細(xì)胞核呈圓形、橢圓形，無(wú)變性，無(wú)固縮或溶解現(xiàn)象。VD模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，神經(jīng)元變性，體積變小，胞核與胞漿界限不清，核固縮成三角形或不規(guī)則形，而且隨I/R時(shí)間的延長(zhǎng)，變性神經(jīng)元數(shù)目越多，見(jiàn)圖1. 表1 各組逃避潛伏期比較
2.3 凋亡蛋白表達(dá)結(jié)果
2.3.1 VD大鼠模型海馬CA1區(qū)Bcl?2表達(dá) VD模型組I/R 2 h Bcl?2蛋白平均OD值開(kāi)始明顯上調(diào)，I/R 8 h達(dá)到高峰，之后隨I/R時(shí)間的延長(zhǎng)開(kāi)始下降，但I(xiàn)/R 24 h組仍高于假手術(shù)組。假手術(shù)組與I/R不同時(shí)間點(diǎn)組間，Bcl?2的表達(dá)情況均有顯著差異（P<0.01）（表2）。
2.3.2 VD大鼠模型海馬CA1區(qū)Bax的表達(dá) I/R早期Bax在海馬CA1區(qū)的表達(dá)明顯增強(qiáng)，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量不斷增加，I/R 72——168 h達(dá)高峰。假手術(shù)組與I/R不同時(shí)間點(diǎn)組之間，Bax的表達(dá)均有顯著差異（P<0.01）（表2）。
2.3.3 Bcl?2/Bax比率變化 隨I/R時(shí)間的延長(zhǎng)，Bcl?2/Bax的比率逐漸降低（表2）。表2 VD大鼠Bcl?2、Bax的表達(dá)水平與假手術(shù)組比較：1）P<0.05,2）P<0.01
2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率結(jié)果 隨著I/R時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率逐漸增高，其中I/R 2 h組凋亡率最低，I/R 168 h組凋亡率最高。VD模型各時(shí)間組與假手術(shù)組比較，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加（P<0.01）；I/R不同時(shí)間組間兩兩比較，各組間海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均差異顯著（P<0.01），見(jiàn)表3.
2.5 血清H2S含量檢測(cè)結(jié)果 隨著I/R時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠血清H2S含量呈現(xiàn)直線降低趨勢(shì)，其中IR 2 h組血清H2S含量最高，I/R 168 h組血清H2S含量最低。VD模型各時(shí)間組與正常組和假手術(shù)組比較，血清H2S含量明顯減少（P<0.01）；I/R不同時(shí)間組間兩兩比較，血清H2S含量均差異顯著（P<0.01）；正常組和假手術(shù)組血清H2S含量無(wú)顯著差異（P>0.05），見(jiàn)表3.
2.6 血清H2S含量與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率相關(guān)分析 隨著血清H2S含量的降低，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率逐漸升高，兩者呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)，回歸方程為：y=-0.135x+12.068,相關(guān)系數(shù)r=-0.861（P<0.01），提示內(nèi)源性H2S可能具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功能。表3 各組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及血清H2S含量（各組間兩兩比較：1）P<0.01
3 討 論
目前認(rèn)為，I/R后神經(jīng)元死亡的機(jī)制是損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，腦缺血性損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)大多以能量衰竭和興奮性氨基酸毒性開(kāi)始，以細(xì)胞凋亡結(jié)束。本實(shí)驗(yàn)中用HE染色觀察到海馬CA1區(qū)大量細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡特征，VD模型組大鼠海馬CA1區(qū)可見(jiàn)神經(jīng)元排列紊亂，神經(jīng)元變性，體積變小，核固縮成三角形或不規(guī)則形，胞核與胞漿界限不清。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率發(fā)現(xiàn)VD模型各組與假手術(shù)組相比海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加，而且隨著I/R時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率逐漸增加。
在參與調(diào)控神經(jīng)元凋亡的基因和蛋白質(zhì)產(chǎn)物中，一類(lèi)是抗凋亡蛋白，包括Bcl?2,Bcl?xL,Bcl?ω，Al等；另一類(lèi)是促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bad等〔4〕。體外研究顯示〔5〕：Bcl?2保護(hù)細(xì)胞免于各種損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VD模型組I/R 2 h后Bcl?2蛋白平均光密度值開(kāi)始明顯上調(diào)，IR 8 h達(dá)到高峰，之后開(kāi)始下降，但I(xiàn)R 72 h仍高于假手術(shù)組；而B(niǎo)ax蛋白在I/R早期在海馬CA1區(qū)的表達(dá)明顯增強(qiáng)，且隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)不斷增加。Bcl?2蛋白家族中促凋亡和抑凋亡兩類(lèi)蛋白的比例即Bcl?2/Bax的比率決定細(xì)胞在受到凋亡信號(hào)刺激后是否發(fā)生凋亡〔6〕，本次研究顯示Bcl?2/Bax的比率隨I/R時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，而大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率則逐漸增加，這也從另一方面證實(shí)了Bcl?2蛋白的抗凋亡作用。
VD主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的降低，而海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要結(jié)構(gòu)，I/R損傷后海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡勢(shì)必對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生重要的影響。本研究利用Morris水迷宮技術(shù)對(duì)VD模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)I/R 720 h組較正常組和假手術(shù)組的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，表明VD可造成大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙，其機(jī)制可能是I/R損傷引起海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致海馬學(xué)習(xí)記憶功能障礙。
H2S是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后被發(fā)現(xiàn)的另一種具有神經(jīng)調(diào)節(jié)作用的新型氣體信號(hào)分子〔7〕，H2S不僅在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要的生理作用，而且還可作為一種內(nèi)源性的抗氧化劑，在氧化應(yīng)激時(shí)能夠清除羥自由基等活性氧簇〔8,9〕，具有抗氧化、恢復(fù)認(rèn)知功能、調(diào)節(jié)腦血流量等作用，也提示H2S可能也參與老年癡呆動(dòng)物或病人神經(jīng)元的保護(hù)〔10〕。本研究結(jié)果顯示隨著大腦I/R時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠血清H2S含量均減少，而海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)逐漸增加；隨著血清H2S含量的降低，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率逐漸升高，兩者間呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示內(nèi)源性H2S對(duì)腦I/R損傷中的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，可以減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。關(guān)于H2S發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制尚不十分清楚，有研究表明，對(duì)于體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，H2S可通過(guò)直接清除H2O2和O?2而減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的生成〔11〕；對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞，H2S可抑制過(guò)氧亞硝酸鹽介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子的氧化和硝基化〔8〕，或者通過(guò)促進(jìn)還原型谷胱甘肽的產(chǎn)生而對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷〔9〕，H2S被證實(shí)可激活A(yù)TP敏感的K通道（KATP）〔12〕，從而起到細(xì)胞保護(hù)作用。綜上所述，I/R損傷可引起內(nèi)源性H2S含量降低，從而導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高；I/R損傷后大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙是海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的必然結(jié)果。因此，提供外源性H2S或H2S供體以降低海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率可能是治療VD的新方法。
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