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肺結(jié)核病人皰疹病毒感染的檢測和臨床意義
肺結(jié)核病人皰疹病毒感染的檢測和臨床意義作者：紀(jì)靜 許俊華 徐翮飛 羅兵
【摘要】 目的 探討肺結(jié)核病人皰疹病毒活動性感染情況。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），檢測62例肺結(jié)核病人和43例正常對照者血清中人巨細(xì)胞病毒（HCMV）和單純皰疹病毒（HSV）特異性IgM抗體以及EB病毒（EBV）衣殼抗原（VCA）IgM抗體。 同時，采用PCR?Southern檢測肺結(jié)核病人和正常人外周血單個核細(xì)胞中EBV DNA表達(dá)。結(jié)果 肺結(jié)核組血清HCMV?IgM和HSV?IgM陽性率分別為19.4%和12.9%,正常對照組分別為4.7% 和0,肺結(jié)核組HCMV?IgM和HSV?IgM陽性率均高于正常對照組（χ2=4.75、4.31,P<0.01）。肺結(jié)核組和正常對照組均未檢測到EB病毒VCA?IgM,肺結(jié)核組EBV DNA陽性率（48.4%）高于正常對照組（4.7%），差異有顯著性（χ2=22.92,P<0.01）。繼發(fā)性肺結(jié)核皰疹病毒感染率（39.6%）高于原發(fā)性肺結(jié)核（7.1%），差異有顯著性 （χ2=3.84,P<0.05）。結(jié)論 部分肺結(jié)核病人存在HCMV、HSV以及EBV的活動性感染，人皰疹病毒感染可能影響肺結(jié)核病情發(fā)生發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】 單純皰疹病毒屬；結(jié)核，肺；酶聯(lián)免疫吸附測定
[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the active infection of human herpesvirus in patients with tuberculosis （TB）。Me?thodsThe specific IgM antibodies against human cytomegalovirus （HCMV）， herpes simplex virus （HSV） and VCA of Epstein?Barr virus （EBV） in serum of 62 TB patients and 43 normal controls were detected by ELISA, and the expression of EBV DNA in mononuclear cells in peripheral blood of both groups by PCR?Southern.ResultsThe positive rates of anti?HCMV and anti?HSV IgM in the patients were 19.4% and 12.90%, respectively,and that in the control groups were 4.7% and 0. The positive HCMV?IgM and HSV?IgM in the patients were higher than that in the controls （χ2=4.75,4.31;P<0.01）。 However, VCA?IgM of EBV was not detected in both groups. The positive rate of EBV?DNA in the patients （48.4%） was significantly higher than that of the controls （4.7%,χ2=22.92,P<0.01）。 The infection of herpesvirus was higher in secondary TB （39.6%） than primary （7.1%）， the difference was significant （χ2=3.84,P<0.05）。ConclusionActive infection of HCMV,HSV and EBV exists in some TB patients,which suggests that human herpesvirus infection might impact the pathogenesis of TB.
[KEY WORDS]Simplexvirus; Tuberculosis, pulmonary; Enzyme linked immunosorbent assay
結(jié)核病的發(fā)病率近年來有增加趨勢，嚴(yán)重危害人類健康，我國每年約有25萬人死于各種結(jié)核病，位居各類傳染病之首，結(jié)核病再次成為迫切需要解決的公共衛(wèi)生問題。結(jié)核病病人尤其是重癥病人常并發(fā)病毒感染，進(jìn)而可引起難治性結(jié)核。人皰疹病毒在人群中具有較高的感染率，通常表現(xiàn)為潛伏感染，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時可引起激活感染。本研究采集62例肺結(jié)核病人的血清，檢測人巨細(xì)胞病毒（HCMV）?IgM、單純皰疹病毒（HSV）?IgM和EB病毒衣殼抗原（VCA）?IgM抗體及外周血單個核細(xì)胞（PBMC）EBV DNA表達(dá)，了解肺結(jié)核病人皰疹病毒的感染狀態(tài)，現(xiàn)報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
本文62例肺結(jié)核病人為2006年7——12月在青島市胸科醫(yī)院呼吸科門診就診及住院病人，男36例，女26例；年齡15——85歲，平均50歲。診斷均符合世界衛(wèi)生組織結(jié)核病會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1].其中原發(fā)性肺結(jié)核14例，繼發(fā)性肺結(jié)核48例。正常對照組43例，來自健康查體人群，年齡和性別與肺結(jié)核組相匹配。
1.2 特異性IgM抗體的檢測
采集正常對照組和肺結(jié)核病人外周血，分離血清，采用ELISA法檢測HCMV?IgM、HSV?IgM和VCA?IgM 抗體，ELISA檢測試劑盒購自德國9VATEC公司。HSV抗體檢測試劑盒不分型別，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作，對陽性和可疑陽性標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢驗。
1.3 EBV DNA的檢測
1.3.1 DNA樣本制備
采集正常對照組和肺結(jié)核病人的外周靜脈血，EDTA抗凝，分離PBMC,酚?氯仿?異戊醇法常規(guī)提取細(xì)胞DNA,預(yù)冷無水乙醇沉淀核酸，自然干燥后用TE緩沖液（pH 8.0）溶解DNA,4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?br />
1.3.2 PCR?Southern
參照文獻(xiàn)[2]方法，選用EBV BamHⅠ?W 區(qū)特異性引物和探針，對提取細(xì)胞DNA 進(jìn)行檢測，上游引物序列為： 5′?CCAGACAGCAGCCAATTGTC?3′，下游引物序列為： 5′?GGTAGAAGACCCCCTCTTAC ?3′，探針序列為：5′?CCCTGGTATAAAGTGGTCCTGCAGCTATT?TCTGGTCGCATC?3′。PCR反應(yīng)總體積為25 μL,反應(yīng)體系為：10×Buffer 2.5 μL,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,上下游引物各0.5μmol/L, Taq DNA 聚合酶1.0 U,DNA 模板3 μL,同時設(shè)立陽性對照和陰性對照。陽性對照為EBV陽性的B95?8細(xì)胞，陰性對照為EBV陰性細(xì)胞系Ramos細(xì)胞。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;然后94 ℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72 ℃ 45 s,擴(kuò)增35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min.取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL 以20 g/ L 瓊脂糖凝膠電泳后轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，與地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，經(jīng)堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體作用后，加酶的發(fā)光底物CSPD 作用5 min,自顯影檢測雜交信號。
1.4 統(tǒng)計學(xué)處理
采用四格表χ2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
2 結(jié) 果
2.1 特異性IgM抗體檢測
肺結(jié)核組HCMV?IgM陽性率高于正常對照組，差異有顯著性（χ2=4.75,P<0.05）；HSV?IgM抗體陽性率也高于正常對照組，差異有顯著性（校正χ2=4.31,P<0.05）；但肺結(jié)核組與正常對照組VCA?IgM 抗體均為陰性。見表1. 表1 肺結(jié)核組與正常對照組血清3種皰疹病毒特異性IgM抗體陽性率比較（略）
2.2 不同型肺結(jié)核病人血清HCMV?IgM和HSV?IgM抗體檢測
原發(fā)性肺結(jié)核14例中HCMV?IgM 陽性1例，陽性率為7.1% ;繼發(fā)性肺結(jié)核48例中HCMV?IgM 陽性11例，HSV?IgM陽性8例，陽性率為
39.6%.繼發(fā)性肺結(jié)核與原發(fā)性肺結(jié)核兩種皰疹病毒抗體IgM檢出陽性率比較差異有顯著性（χ2=3.84,P<0.05）。
2.3 EBV DNA檢測
肺結(jié)核組EBV DNA陽性率為48.4%（30/62），正常對照組EBV DNA陽性率為4.7%（2/43），肺結(jié)核組EBV DNA陽性率明顯高于正常對照組，差異有顯著性（χ2=22.92,P<0.01）。
3 討 論
皰疹病毒屬DNA病毒，在我國人群中感染非常普遍，通常為潛伏感染，不引起臨床癥狀，但在一定條件下可激活。 與人類疾病有關(guān)的皰疹病毒有8 型，依次為單純皰疹病毒1 型及2型（HSV?1、HSV?2）、水痘?帶狀皰疹病毒、Epstein?Barr病毒（EBV）、HCMV、人類皰疹病毒6型（HHV?6）、人類皰疹病毒7型（HHV?7）型和人類皰疹病毒8型（HHV?8）[3].目前世界范圍內(nèi)肺結(jié)核發(fā)病率呈升高趨勢，肺結(jié)核病人尤其是重癥肺結(jié)核病人若并發(fā)皰疹病毒感染，易造成診斷困難，病情復(fù)雜化以及療效差等。本文對青島地區(qū)肺結(jié)核病人皰疹病毒的感染情況進(jìn)行了初步研究。
血清特異性IgM抗體出現(xiàn)或效價升高被認(rèn)為是病毒早期感染和潛伏病毒激活的標(biāo)志之一。本文研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核病人血清HCMV?IgM和HSV?IgM抗體陽性率明顯高于正常對照組，提示肺結(jié)核病人存在HCMV和 HSV的活動性感染。SKRIAGINA等[4]檢測了44例急性發(fā)作期肺結(jié)核病人血清，結(jié)果證實肺結(jié)核病人存在HSV的機(jī)會性感染。很多文獻(xiàn)已經(jīng)證實，在機(jī)體免疫功能低下時常誘發(fā)皰疹病毒的活動性感染，肺結(jié)核病人多伴有細(xì)胞免疫功能紊亂，可導(dǎo)致潛伏感染狀態(tài)的病毒激活，而活動性病毒感染又可促使結(jié)核菌活動，進(jìn)而影響肺結(jié)核病人病情發(fā)生發(fā)展。免疫缺陷者分支桿菌感染概率明顯增加，發(fā)生結(jié)核病的概率較正常人高得多。有文獻(xiàn)報道，HCMV感染可引起短時間免疫缺陷，而免疫缺陷亦易引起HCMV感染[5]. SIRENKO等[6]對65例肺結(jié)核病人的研究顯示，與病情穩(wěn)定的肺結(jié)核病人比較，病情復(fù)雜的肺結(jié)核病人皰疹病毒IgM抗體檢出率顯著增高，提示巨細(xì)胞病毒感染可能影響肺結(jié)核的發(fā)生及病情進(jìn)展。本文研究結(jié)果表明，繼發(fā)性肺結(jié)核病人HCMV和 HSV活動性感染率明顯高于原發(fā)性肺結(jié)核。
VCA?IgM是EBV原發(fā)感染的標(biāo)志，其在活動性感染中是否陽性目前尚無定論。有研究認(rèn)為，VCA?IgM僅見于EBV的原發(fā)感染；個別研究發(fā)現(xiàn)激活感染時，VCA?IgM陽性。本研究同時檢測VCA?IgM和EBV DNA,結(jié)果顯示，肺結(jié)核組和正常對照組血清均未檢測到VCA?IgM抗體， 支持VCA?IgM僅見于EBV原發(fā)感染的觀點；而肺結(jié)核病人EBV DNA的陽性率高于正常對照組， 提示可能存在潛伏EBV的激活感染。因此，有必要對EBV DNA載量進(jìn)行檢測，以進(jìn)一步明確結(jié)核病人EBV 的感染狀況。
皰疹病毒感染有潛伏感染和活動性感染兩種形式，潛伏感染時病毒以相對非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞內(nèi)，宿主細(xì)胞常常包含多個拷貝的病毒DNA,大部分保持游離形式，部分能與宿主細(xì)胞基因組整合，在某些因素作用下病毒可由潛伏狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒訝顟B(tài)[7].肺結(jié)核系慢性消耗性疾病，可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低，作為肺結(jié)核非病因性的人皰疹病毒潛伏感染可被激活，而皰疹病毒感染可能進(jìn)一步導(dǎo)致免疫功能低下，從而影響病情進(jìn)展。因此，對肺結(jié)核病人可檢查皰疹病毒活動性感染指標(biāo)，對伴有活動性感染者在用抗結(jié)核藥物的同時使用抗皰疹病毒類藥物，可緩解病人病情，有利于病人康復(fù)。
【參考文獻(xiàn)】
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