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肺結(jié)核病人皰疹病毒感染的檢測(cè)和臨床意義
肺結(jié)核病人皰疹病毒感染的檢測(cè)和臨床意義作者：紀(jì)靜 許俊華 徐翮飛 羅兵
【摘要】 目的 探討肺結(jié)核病人皰疹病毒活動(dòng)性感染情況。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），檢測(cè)62例肺結(jié)核病人和43例正常對(duì)照者血清中人巨細(xì)胞病毒（HCMV）和單純皰疹病毒（HSV）特異性IgM抗體以及EB病毒（EBV）衣殼抗原（VCA）IgM抗體。 同時(shí)，采用PCR?Southern檢測(cè)肺結(jié)核病人和正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞中EBV DNA表達(dá)。結(jié)果 肺結(jié)核組血清HCMV?IgM和HSV?IgM陽(yáng)性率分別為19.4%和12.9%,正常對(duì)照組分別為4.7% 和0,肺結(jié)核組HCMV?IgM和HSV?IgM陽(yáng)性率均高于正常對(duì)照組（χ2=4.75、4.31,P<0.01）。肺結(jié)核組和正常對(duì)照組均未檢測(cè)到EB病毒VCA?IgM,肺結(jié)核組EBV DNA陽(yáng)性率（48.4%）高于正常對(duì)照組（4.7%），差異有顯著性（χ2=22.92,P<0.01）。繼發(fā)性肺結(jié)核皰疹病毒感染率（39.6%）高于原發(fā)性肺結(jié)核（7.1%），差異有顯著性 （χ2=3.84,P<0.05）。結(jié)論 部分肺結(jié)核病人存在HCMV、HSV以及EBV的活動(dòng)性感染，人皰疹病毒感染可能影響肺結(jié)核病情發(fā)生發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】 單純皰疹病毒屬；結(jié)核，肺；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定
[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the active infection of human herpesvirus in patients with tuberculosis （TB）。Me?thodsThe specific IgM antibodies against human cytomegalovirus （HCMV）， herpes simplex virus （HSV） and VCA of Epstein?Barr virus （EBV） in serum of 62 TB patients and 43 normal controls were detected by ELISA, and the expression of EBV DNA in mononuclear cells in peripheral blood of both groups by PCR?Southern.ResultsThe positive rates of anti?HCMV and anti?HSV IgM in the patients were 19.4% and 12.90%, respectively,and that in the control groups were 4.7% and 0. The positive HCMV?IgM and HSV?IgM in the patients were higher than that in the controls （χ2=4.75,4.31;P<0.01）。 However, VCA?IgM of EBV was not detected in both groups. The positive rate of EBV?DNA in the patients （48.4%） was significantly higher than that of the controls （4.7%,χ2=22.92,P<0.01）。 The infection of herpesvirus was higher in secondary TB （39.6%） than primary （7.1%）， the difference was significant （χ2=3.84,P<0.05）。ConclusionActive infection of HCMV,HSV and EBV exists in some TB patients,which suggests that human herpesvirus infection might impact the pathogenesis of TB.
[KEY WORDS]Simplexvirus; Tuberculosis, pulmonary; Enzyme linked immunosorbent assay
結(jié)核病的發(fā)病率近年來(lái)有增加趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類健康，我國(guó)每年約有25萬(wàn)人死于各種結(jié)核病，位居各類傳染病之首，結(jié)核病再次成為迫切需要解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題。結(jié)核病病人尤其是重癥病人常并發(fā)病毒感染，進(jìn)而可引起難治性結(jié)核。人皰疹病毒在人群中具有較高的感染率，通常表現(xiàn)為潛伏感染，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)可引起激活感染。本研究采集62例肺結(jié)核病人的血清，檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒（HCMV）?IgM、單純皰疹病毒（HSV）?IgM和EB病毒衣殼抗原（VCA）?IgM抗體及外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）EBV DNA表達(dá)，了解肺結(jié)核病人皰疹病毒的感染狀態(tài)，現(xiàn)報(bào)告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
本文62例肺結(jié)核病人為2006年7——12月在青島市胸科醫(yī)院呼吸科門診就診及住院病人，男36例，女26例；年齡15——85歲，平均50歲。診斷均符合世界衛(wèi)生組織結(jié)核病會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1].其中原發(fā)性肺結(jié)核14例，繼發(fā)性肺結(jié)核48例。正常對(duì)照組43例，來(lái)自健康查體人群，年齡和性別與肺結(jié)核組相匹配。
1.2 特異性IgM抗體的檢測(cè)
采集正常對(duì)照組和肺結(jié)核病人外周血，分離血清，采用ELISA法檢測(cè)HCMV?IgM、HSV?IgM和VCA?IgM 抗體，ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)9VATEC公司。HSV抗體檢測(cè)試劑盒不分型別，參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，對(duì)陽(yáng)性和可疑陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)。
1.3 EBV DNA的檢測(cè)
1.3.1 DNA樣本制備
采集正常對(duì)照組和肺結(jié)核病人的外周靜脈血，EDTA抗凝，分離PBMC,酚?氯仿?異戊醇法常規(guī)提取細(xì)胞DNA,預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀核酸，自然干燥后用TE緩沖液（pH 8.0）溶解DNA,4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?br />
1.3.2 PCR?Southern
參照文獻(xiàn)[2]方法，選用EBV BamHⅠ?W 區(qū)特異性引物和探針，對(duì)提取細(xì)胞DNA 進(jìn)行檢測(cè)，上游引物序列為： 5′?CCAGACAGCAGCCAATTGTC?3′，下游引物序列為： 5′?GGTAGAAGACCCCCTCTTAC ?3′，探針序列為：5′?CCCTGGTATAAAGTGGTCCTGCAGCTATT?TCTGGTCGCATC?3′。PCR反應(yīng)總體積為25 μL,反應(yīng)體系為：10×Buffer 2.5 μL,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,上下游引物各0.5μmol/L, Taq DNA 聚合酶1.0 U,DNA 模板3 μL,同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照為EBV陽(yáng)性的B95?8細(xì)胞，陰性對(duì)照為EBV陰性細(xì)胞系Ramos細(xì)胞。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;然后94 ℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72 ℃ 45 s,擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min.取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL 以20 g/ L 瓊脂糖凝膠電泳后轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，與地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，經(jīng)堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體作用后，加酶的發(fā)光底物CSPD 作用5 min,自顯影檢測(cè)雜交信號(hào)。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用四格表χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
2 結(jié) 果
2.1 特異性IgM抗體檢測(cè)
肺結(jié)核組HCMV?IgM陽(yáng)性率高于正常對(duì)照組，差異有顯著性（χ2=4.75,P<0.05）；HSV?IgM抗體陽(yáng)性率也高于正常對(duì)照組，差異有顯著性（校正χ2=4.31,P<0.05）；但肺結(jié)核組與正常對(duì)照組VCA?IgM 抗體均為陰性。見(jiàn)表1. 表1 肺結(jié)核組與正常對(duì)照組血清3種皰疹病毒特異性IgM抗體陽(yáng)性率比較（略）
2.2 不同型肺結(jié)核病人血清HCMV?IgM和HSV?IgM抗體檢測(cè)
原發(fā)性肺結(jié)核14例中HCMV?IgM 陽(yáng)性1例，陽(yáng)性率為7.1% ;繼發(fā)性肺結(jié)核48例中HCMV?IgM 陽(yáng)性11例，HSV?IgM陽(yáng)性8例，陽(yáng)性率為
39.6%.繼發(fā)性肺結(jié)核與原發(fā)性肺結(jié)核兩種皰疹病毒抗體IgM檢出陽(yáng)性率比較差異有顯著性（χ2=3.84,P<0.05）。
2.3 EBV DNA檢測(cè)
肺結(jié)核組EBV DNA陽(yáng)性率為48.4%（30/62），正常對(duì)照組EBV DNA陽(yáng)性率為4.7%（2/43），肺結(jié)核組EBV DNA陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照組，差異有顯著性（χ2=22.92,P<0.01）。
3 討 論
皰疹病毒屬DNA病毒，在我國(guó)人群中感染非常普遍，通常為潛伏感染，不引起臨床癥狀，但在一定條件下可激活。 與人類疾病有關(guān)的皰疹病毒有8 型，依次為單純皰疹病毒1 型及2型（HSV?1、HSV?2）、水痘?帶狀皰疹病毒、Epstein?Barr病毒（EBV）、HCMV、人類皰疹病毒6型（HHV?6）、人類皰疹病毒7型（HHV?7）型和人類皰疹病毒8型（HHV?8）[3].目前世界范圍內(nèi)肺結(jié)核發(fā)病率呈升高趨勢(shì)，肺結(jié)核病人尤其是重癥肺結(jié)核病人若并發(fā)皰疹病毒感染，易造成診斷困難，病情復(fù)雜化以及療效差等。本文對(duì)青島地區(qū)肺結(jié)核病人皰疹病毒的感染情況進(jìn)行了初步研究。
血清特異性IgM抗體出現(xiàn)或效價(jià)升高被認(rèn)為是病毒早期感染和潛伏病毒激活的標(biāo)志之一。本文研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核病人血清HCMV?IgM和HSV?IgM抗體陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照組，提示肺結(jié)核病人存在HCMV和 HSV的活動(dòng)性感染。SKRIAGINA等[4]檢測(cè)了44例急性發(fā)作期肺結(jié)核病人血清，結(jié)果證實(shí)肺結(jié)核病人存在HSV的機(jī)會(huì)性感染。很多文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)，在機(jī)體免疫功能低下時(shí)常誘發(fā)皰疹病毒的活動(dòng)性感染，肺結(jié)核病人多伴有細(xì)胞免疫功能紊亂，可導(dǎo)致潛伏感染狀態(tài)的病毒激活，而活動(dòng)性病毒感染又可促使結(jié)核菌活動(dòng)，進(jìn)而影響肺結(jié)核病人病情發(fā)生發(fā)展。免疫缺陷者分支桿菌感染概率明顯增加，發(fā)生結(jié)核病的概率較正常人高得多。有文獻(xiàn)報(bào)道，HCMV感染可引起短時(shí)間免疫缺陷，而免疫缺陷亦易引起HCMV感染[5]. SIRENKO等[6]對(duì)65例肺結(jié)核病人的研究顯示，與病情穩(wěn)定的肺結(jié)核病人比較，病情復(fù)雜的肺結(jié)核病人皰疹病毒IgM抗體檢出率顯著增高，提示巨細(xì)胞病毒感染可能影響肺結(jié)核的發(fā)生及病情進(jìn)展。本文研究結(jié)果表明，繼發(fā)性肺結(jié)核病人HCMV和 HSV活動(dòng)性感染率明顯高于原發(fā)性肺結(jié)核。
VCA?IgM是EBV原發(fā)感染的標(biāo)志，其在活動(dòng)性感染中是否陽(yáng)性目前尚無(wú)定論。有研究認(rèn)為，VCA?IgM僅見(jiàn)于EBV的原發(fā)感染；個(gè)別研究發(fā)現(xiàn)激活感染時(shí)，VCA?IgM陽(yáng)性。本研究同時(shí)檢測(cè)VCA?IgM和EBV DNA,結(jié)果顯示，肺結(jié)核組和正常對(duì)照組血清均未檢測(cè)到VCA?IgM抗體， 支持VCA?IgM僅見(jiàn)于EBV原發(fā)感染的觀點(diǎn)；而肺結(jié)核病人EBV DNA的陽(yáng)性率高于正常對(duì)照組， 提示可能存在潛伏EBV的激活感染。因此，有必要對(duì)EBV DNA載量進(jìn)行檢測(cè)，以進(jìn)一步明確結(jié)核病人EBV 的感染狀況。
皰疹病毒感染有潛伏感染和活動(dòng)性感染兩種形式，潛伏感染時(shí)病毒以相對(duì)非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞內(nèi)，宿主細(xì)胞常常包含多個(gè)拷貝的病毒DNA,大部分保持游離形式，部分能與宿主細(xì)胞基因組整合，在某些因素作用下病毒可由潛伏狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒?dòng)狀態(tài)[7].肺結(jié)核系慢性消耗性疾病，可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低，作為肺結(jié)核非病因性的人皰疹病毒潛伏感染可被激活，而皰疹病毒感染可能進(jìn)一步導(dǎo)致免疫功能低下，從而影響病情進(jìn)展。因此，對(duì)肺結(jié)核病人可檢查皰疹病毒活動(dòng)性感染指標(biāo)，對(duì)伴有活動(dòng)性感染者在用抗結(jié)核藥物的同時(shí)使用抗皰疹病毒類藥物，可緩解病人病情，有利于病人康復(fù)。
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