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鵝膏菌多肽毒素在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用
鵝膏菌多肽毒素在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用張志光 張曉元 李東屏
摘要 鵝膏菌多肽毒素是野生毒磨菇產(chǎn)生的主要毒素，常引起人和動(dòng)物的中毒與死亡。由于鵝膏毒肽對(duì)真核細(xì)胞的RNA聚合酶Ⅱ具有專一性抑制作用以及鬼筆毒肽對(duì)肌動(dòng)蛋白具有束縛作用，它們?cè)谏茖W(xué)研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，并對(duì)生命科學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了很大的促進(jìn)作用。本文擬綜述鵝膏毒肽和鬼筆毒肽在生命科學(xué)中應(yīng)用的研究進(jìn)展。
關(guān)鍵詞 鵝膏菌屬 鵝膏毒肽 鬼筆毒肽 生命科學(xué)
中圖分類號(hào) R996.2 Q949.98
Application of amanita toxic peptides in life sciences research
Zhang Zhiguang, Zhang Xiaoyuan, Li Dongping
Biology Institute of Hunan Normal University,Changsha 410081,China
Amanita toxic peptides are the main toxins in wild mushrooms and often result in animal and human intoxication and death.Due to the specific inhibition to eukaryotic cell RNA polymerases Ⅱ by amatoxins and the binding to actin by phallotoxins,amanita toxic peptides play important roles in life science researches.This paper presents a latest review of applications of amanita toxic peptides in life scientific researches.
Key words:amanita, amatoxins, phallotoxins, life science
人誤食有毒的鵝膏菌（Amanita）后，產(chǎn)生腹瀉、腹痛、嘔吐、幻覺(jué)、昏迷等多種癥狀，致死率相當(dāng)高。在19世紀(jì)60年代后，就已對(duì)鵝膏菌的毒性成份進(jìn)行研究，到本世紀(jì)80年代已分離純化鑒定的鵝膏菌毒素包括鵝膏毒肽（amatoxins）、鬼筆毒肽（phallotoxins）、毒傘素（virotoxins）、毒蠅堿（muscarine）、異惡唑（isoxazole）衍生物、鵝膏氨酸（ibotenic acid）以及muscimol、coprine等[1,2].鵝膏毒肽是一類雙環(huán)八肽，天然的鵝膏毒肽包括α-鵝膏毒肽（α-amanitin,又譯為“鵝膏菌堿”）。β-鵝膏毒肽（β-amanitin）、r-鵝膏毒肽、ε-鵝膏毒肽、三羥鵝膏毒肽（amanin）、三羥鵝膏毒肽酰胺（amaninamide）、二羥鵝膏毒肽酰胺（amanullin）、二羥鵝膏毒肽羧酸（amanullinic acid）、和二羥鵝膏毒肽酰胺原（proamanullin）九種。鬼筆毒肽是一類雙環(huán)七肽、天然的鬼筆毒肽包括二羥鬼筆毒肽（phalloidin）、一羥鬼筆毒肽（phalloin）、三羥鬼筆毒肽（phallisin）、一羥鬼筆毒肽原（prophalloin）、羧基一羥鬼筆毒肽（phallisacin）、羧基二羥鬼筆毒肽（phallacidin）、羥基三羥鬼筆毒肽（phallsacin）七種。毒傘素是一類單環(huán)七肽，其天然毒性成分有6種。在鵝膏菌毒素中，引致人和動(dòng)物死亡的主要為amatoxins,LD50（小白鼠）一般為0.2——0.5mg/kg,從人中毒事件分析，人的LD50則更低[3].amatoxins屬于慢作用毒素，一般中毒后5——12天死亡，死亡率高達(dá)90%,而phallotoxins為快作用毒素。動(dòng)物腹腔毒性試驗(yàn)，在2——4h引致死亡，LD50為1.5——4.0mg/kg[4].virotoxins的毒性及機(jī)理和phallotoxin相似。
在鵝膏菌多肽毒素的研究過(guò)程中，由于發(fā)現(xiàn)了α-amanitin對(duì)真核生物RNA聚合酶Ⅱ的專一性抑制作用和phalloidin對(duì)肌動(dòng)蛋白的專一性束縛作用，從而推動(dòng)了分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展。反過(guò)來(lái)，由于這些學(xué)科的實(shí)驗(yàn)研究中對(duì)amanitin和phalloidin及其衍生物的應(yīng)用也不斷地促進(jìn)和豐富了對(duì)鵝膏菌多肽毒素的研究和應(yīng)用。鵝膏菌多肽毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、毒理等已由Wieland和Faulstich進(jìn)行了綜述與評(píng)論[1,5].本文擬對(duì)鵝膏菌多肽毒素（主要為amatoxins和phallotoxins）在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。
1 真核細(xì)胞mRNA合成的專一性抑制劑
自α-amanitin被分離純化后，其毒性機(jī)理經(jīng)過(guò)十多年的研究，直到Fiume等人觀察到amanitin中毒的小白鼠肝細(xì)胞的核仁碎裂，并且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核中RNA含量持續(xù)減少[6],鵝膏毒肽作用的分子機(jī)理才得以逐步揭示出來(lái)。體外或體內(nèi)由amanitin處理的鼠肝細(xì)胞核的RNA合成被嚴(yán)重阻斷，認(rèn)為amanitin抑制RNA聚合酶的活性[7].Seifart和Sekeris（1969）發(fā)現(xiàn)10 ng/ml的α-amanitin抑制了體外的依賴于DNA的RAN聚合酶活性[8].由于Roeder和Rutter（1969）成功地從海膽胚胎中分離出三種RNA聚合酶，并且從鼠肝中分離出兩種RNA聚合酶（Ⅰ和Ⅱ，以后又分離第Ⅲ種）[9],隨即，確定了α-amanitin（低至5——10 ng/ml的濃度）是抑制了海膽、鼠肝和小牛胸腺的RNA聚合酶Ⅱ的活性，而對(duì)RNA聚合酶Ⅰ不起作用[10,11],并且也發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶Ⅲ對(duì)α-amanitin也敏感，但其被抑制的濃度為RNA聚合酶Ⅱ的103——104倍高濃度[12].Vaisius 和Wieland進(jìn)一步揭示出[13],amatoxins對(duì)RNA聚合酶Ⅱ的抑制是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制型，它們是阻止RNA聚合酶Ⅱ在一磷酸二酯鍵形成后與新生RNA沿DNA模板的移位，它們和RNA聚合酶Ⅱ、DNA模板與新生的RNA形成穩(wěn)定的四元復(fù)合物，因?yàn)樵讦?鵝膏毒肽存在時(shí)，RNA聚合酶仍能合成二核苷酸。
amanitin對(duì)線粒體內(nèi)的RAN聚合酶（濃度高達(dá)40[13]）、葉綠體內(nèi)的聚合酶（濃度高達(dá)100[13]）以及原核生物的RNA聚合酶沒(méi)有抑制作用[14,15].不同真核生物的RNA聚合酶Ⅱ?qū)Ζ?amanitin的敏感程度有很大的差異，一般是進(jìn)化越高級(jí)的生物則其被抑制的程度越高。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞、以及魚和昆蟲的RNA聚合酶Ⅱ?qū)Ζ?amnaitin高度敏感，其抑制常數(shù)（Ki）為3×10-9——5×10-8M[16——19],植物的RNA聚合酶Ⅱ的Ki較動(dòng)物的高些[20,21].而一般的真菌的RNA聚合酶Ⅱ的Ki較植物高10到幾百倍[22——24].在鵝膏菌屬中，含與不含amantoxins的種間的RNA聚合酶Ⅱ?qū)Ζ?amanitin的Ki是有懸殊差異的[25],Johoson等報(bào)道含有amatoxins的A.hygroscopica和A.suballiacea的子實(shí)體的RNA聚合酶Ⅱ的Ki分別為2.0×10-3M和3.3×10-3M,而不聚積amatoxins的A.brunnescens和A.alliacea的Ki分別為1.0×10-5M和9.8×10-6M[26],這說(shuō)明自身含有amatoxins的鵝膏菌對(duì)amatoxins有很高的抗性。這些研究表明在應(yīng)用amntoxins抑制真核生物的mRNA生物合成時(shí)，要根據(jù)不同的物種的具體情況而定。
2 基因的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞定位
低濃度的amatoxins抑制真核生物RNA聚合酶Ⅱ的活性，高濃度的amatoxins一般能抑制RNA聚合酶Ⅲ的活性，而對(duì)RNA聚合酶Ⅰ無(wú)作用。amatoxins的這一特性使之成為一類非常有用的生物試劑，它們與RNA聚合酶Ⅰ的專一性抑制劑放線菌素D[27,28]、RNA聚合酶Ⅲ的專一性抑制劑tagetitoxin以及蛋白質(zhì)合成的抑制劑放線菌酮等一起研究真核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)組織、功能與表達(dá)及調(diào)控。
應(yīng)用RNA聚合酶對(duì)α-amanitin的敏感性差異可以確定基因的轉(zhuǎn)錄是由哪一類RNA聚合酶控制。Kundel等發(fā)現(xiàn)hnmRNA的后熟依賴snRNA U6,該snRNA為RNA聚合酶Ⅰ合成，而其它幾種snRNA為RNA聚合酶Ⅲ合成[29].通過(guò)離體轉(zhuǎn)錄發(fā)現(xiàn)人的L1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄被Tagetitoxin抑制而不被α-amanitin抑制，這不同于果蠅的L1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄受α-amanitin所抑制，從而表明人L1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子啟動(dòng)子是RNA聚合酶Ⅲ依賴性的[30].在Leishmania donovani中發(fā)現(xiàn)2.2Mb染色體上兩個(gè)LD1基因在同源重組時(shí)被復(fù)制到1.2Mb染色體上的rRNA基因座上，被RNA聚合酶Ⅰ所轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為抗α-amanitin,而在2.2Mb染色體上的兩個(gè)基因被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而被α-amanitin抑制，結(jié)果導(dǎo)致這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄豐度和表達(dá)的基因產(chǎn)物都比正常的要高[31].
借助抗α-amanitin的突變的特性除研究轉(zhuǎn)錄中酶的動(dòng)力學(xué)特性和分子機(jī)理外，還可觀察細(xì)胞融合的雜合子的基因表達(dá)。Zuckerman等將雞紅細(xì)胞與抗α-amanitin的鼠原粒細(xì)胞（myeloblast）融合，在抑制雞RNA的聚合酶Ⅱ的α-amanitin存在時(shí)，而雞的專一性蛋白仍被合成[32].
amatoxins對(duì)于基因的細(xì)胞定位研究也有重要意義。Padetzky等（1987）發(fā)現(xiàn)藻類的RuBP羧化酶的小亞基是核內(nèi)基因編碼，可被α-amanitin所抑制，而大亞基的基因在葉綠體中，其表達(dá)被原核生物的轉(zhuǎn)錄和翻譯的抑制劑所抑制[33].
3 基因的表達(dá)和調(diào)控
在細(xì)胞分裂和分化發(fā)育過(guò)程中，α-amanitin被當(dāng)作抑制劑用于分析和研究不同的RNA聚合酶的發(fā)生順序和功能。這些研究在動(dòng)物發(fā)育方面尤為突出，如小鼠卵細(xì)胞和胚胎、兔受精卵、瓜蟾和海膽的卵等[34——39].Sevigny利用amatoxin的抑制轉(zhuǎn)錄特性，研究小白鼠受精卵的發(fā)育，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)伴侶蛋白TRiC的一個(gè)亞基TRiC-P5在胚胎中表達(dá)是在二細(xì)胞時(shí)期，是受精卵基因組激活合成的首個(gè)蛋白產(chǎn)物[40].Marakhova等研究發(fā)現(xiàn)人淋巴細(xì)胞快速轉(zhuǎn)化中Na,K-ATP酶陽(yáng)離子泵的長(zhǎng)期增強(qiáng)首先受翻譯然后受轉(zhuǎn)錄的控制，他們用植物凝集素激活人淋巴細(xì)胞從間期轉(zhuǎn)換到分裂期時(shí)觀察到在起始階段（5——20h）、陽(yáng)離子泵的正調(diào)節(jié)可被放線菌酮所抑制，而α-amanitin和放線菌素D不起作用，第二階段（20h后）則相反，其調(diào)節(jié)被α-amanitin抑制，而放線菌酮不起作用[41].
4 腫瘤和病毒的研究
amatoxins對(duì)于腫瘤治療具有誘人的潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值。Grna報(bào)告了用α-amanitin治愈氨基偶氮甲苯（aminoazotoluene）誘發(fā)的小鼠皮膚腫瘤的成果。他反復(fù)向腫瘤注射極稀的α-amanitin,初次注射產(chǎn)生局部炎癥，以后的注射使腫瘤壞死，緊接著損傷部位很快愈合[42].Bermbach等將β-amanitin與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合，由于腫瘤細(xì)胞A431含有的表皮生長(zhǎng)因子的受體含量比正常細(xì)胞高100倍以上，在一定濃度時(shí)，β-amanitin與表皮生長(zhǎng)因子的復(fù)合體主要進(jìn)入A431細(xì)胞，從而抑制A431細(xì)胞的生長(zhǎng)[43].因此，根據(jù)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的差異，利用amatoxins的特性控制和治療腫瘤是治療癌癥的一個(gè)很有前景的途徑。
在病毒的研究方面，amatoxins一直是獲取病毒在細(xì)胞中復(fù)制信息的工具。如果病毒的復(fù)制被amatoxin抑制，則顯示該病毒的繁殖依賴于寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)。一般在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制的DAN病毒對(duì)amatoxins是敏感的，如皰疹病毒、腺病毒12猿病毒、禽支氣管炎病毒和小麥多斑花葉病毒[44——46].在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的DNA病毒，利用病毒自身的聚合酶，對(duì)amatoxins不敏感。對(duì)于RNA病毒，一般不受amatoxins的抑制。但也有一些RNA病毒的復(fù)制被α-amanitin抑制，它們依賴了宿主細(xì)胞的RNA聚合酶，如粘液病毒[47,48].類病毒PSTV和CEV的復(fù)制也受amantoxins的抑制[49].
5 細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能
微絲是構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要成分，其主鏈蛋白由絲狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）構(gòu)成，F(xiàn)-actin是由球狀肌動(dòng)蛋白（G-actin）聚合組裝而成。在正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)-actin與G-actin之間的聚合和解聚是一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡過(guò)程，這一動(dòng)態(tài)過(guò)程的進(jìn)行就關(guān)系到ATP水解釋放能量與細(xì)胞質(zhì)運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和肌肉運(yùn)動(dòng)等生理過(guò)程。phallotoxins專一性地與F-actin結(jié)合，從而極大地穩(wěn)定F-actin的結(jié)構(gòu)。virotoxins也具有與phallotoxins對(duì)F-actin相同的作用機(jī)制。phallotoxins和virotoxins促使了（尤其是最適度以下的條件）G-actin的聚合，并且穩(wěn)定了F-actin的絲狀結(jié)構(gòu)。phalloidin與viroidin和F-actin的解離常數(shù)（KD）很小，phalloidin的KD為3.7×10-8M,3H-demethyl-phalloidin的KD為3.6×10-8M.在相當(dāng)?shù)某潭葍?nèi)，在基質(zhì)稀釋后，phalloidin并不影響G-actin的結(jié)合速率，而是完全阻止了新生的F-actin在兩端的解離。
phallotoxins用熒光物質(zhì)標(biāo)記后，可做為F-actin的探針，在研究細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和功能中有廣泛地應(yīng)用。phallotoxins可被連接多種熒光標(biāo)記，而發(fā)生不同的熒光，主要包括：熒光素（fluorescein,FL）發(fā)生黃綠色熒光、四甲基若丹明（tetramethyrhodamine,RH），產(chǎn)生紅色熒光[50].熒光標(biāo)記的FL-和RH-phallotoxins分別只呈現(xiàn)出phalloidin對(duì)F-actin的10%和20%親和力，因而它們的毒性減小，但它們?nèi)阅芫o密地和專一地束縛F-actin.應(yīng)用熒光標(biāo)記的phallotoxin,可以研究細(xì)胞中F-actin的存在、分布與定位以及actin結(jié)構(gòu)與細(xì)胞運(yùn)輸?shù)萚51,52].
熒光標(biāo)記的phallotoxins對(duì)于肌肉結(jié)構(gòu)的研究具有重要意義[53].Zhukarey等對(duì)骨骼肌和心肌以rhodamine-phalloidin染色后的染色分布的研究結(jié)果支持了伴肌動(dòng)蛋白能阻礙phalloidin對(duì)骨骼肌原纖維束縛和nebulett能阻礙phalloidin對(duì)心肌細(xì)肌絲束縛的假說(shuō)。amatoxins在細(xì)胞核的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的研究中也有重作用。
*國(guó)家科委重點(diǎn)課題93-（7）-03
作者簡(jiǎn)介：張志光，男，大學(xué)，教授
作者單位：張志光 張曉元 李東屏（湖南師范大學(xué)生物所，長(zhǎng)沙 410081）
參考文獻(xiàn)
1 Wieland Th.Peptides of poisonous Amanwta Mushrooms.New York: springer-Verlag Inc,1986
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