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實驗動物塑料飲水瓶消毒條件的優(yōu)化研究
實驗動物塑料飲水瓶消毒條件的優(yōu)化研究龍芝美 吳錦銀 楊光宇 李文學 朱偉
【摘要】 目的應用國家標準推薦的及實驗室常用的高壓滅菌方法對實驗動物塑料飲水瓶進行消毒，觀察三種不同消毒方式（溫度、時間）消毒后塑料飲水瓶浸出液對L-929 細胞生長的影響。方法形態(tài)觀察法和WST-1法。結(jié)果三種消毒方式消毒后，細胞培養(yǎng)基中均未見細菌生長。三種消毒方式下，細胞生長良好，細胞存活率和細胞增殖度均在50%以上。結(jié)論根據(jù)國家標準進行評價，三種高壓滅菌方式對L929 細胞形態(tài)、生長和增殖有一定程度的影響，其中100℃ 60min的消毒方式較好，無細胞毒性作用，消毒后的產(chǎn)品具有良好的生物相容性，符合生物材料應用要求。
【關(guān)鍵詞】 SPF級實驗動物設施；細胞毒性；WST-1法
[Abstract]ObjectiveTo optimize the way of sterilize drinking water utensil used in animal experiment appliance.MethodsCell morphology observation assay and WST-1 assay were used.ResultsAs compared with the control,cell morphology and amount have been affected by the different sterilized ways.ConclusionAccording to the national criterion and the research results,the ways of 100℃ 60min is the better one.
[Key words]SPF grade animal test appliance; Cytotoxicity; WST-1 assay
為保證屏障級實驗動物設施環(huán)境符合國家標準及保證實驗動物和動物實驗的質(zhì)量，所有擬進入實驗動物設施內(nèi)部的物品必須經(jīng)過一定的滅菌方法處理后才能帶入實驗設施內(nèi)。飲水瓶是實驗動物設施內(nèi)動物飲水裝備，其消毒滅菌措施一般為高壓蒸汽滅菌，國家標準推薦的消毒滅菌溫度為121℃維持20min.在實際工作中，發(fā)現(xiàn)動物飲水瓶尤其是新塑料飲水瓶在按照上述方式滅菌處理后會有塑料的臭味，慮及其盛裝的水被直接飲用進入動物體內(nèi)，因此要有良好的理化性能和良好的生物相容性。細胞毒性試驗是利用體外細胞培養(yǎng)方法來評價生物材料、醫(yī)療器材或浸提液成分是否具有潛在的細胞毒性，以其簡便、快捷、靈敏性高、節(jié)省動物等優(yōu)點，被列為評價醫(yī)用器材毒性的重要指標[ 1,2 ].本試驗依據(jù)中華人民共和國國家標準《醫(yī)療生物學評價》（GB/T 16886-2003 ,idt ISO10993-5: 1992），分別采用三種常用的消毒滅菌溫度對盛裝動物飲用水的飲水瓶進行高溫蒸汽滅菌，觀察滅菌后瓶中的飲用水對小鼠成纖維細胞L-929生長抑制的影響，以評價這三種滅菌條件何者為優(yōu)，為日常工作提供數(shù)據(jù)支持。
1材料與方法
1.1主要材料及試劑動物飲水瓶購于中國江蘇楓葉實驗動物籠具廠。L-929小鼠成纖維細胞株，購自中國科學院上海細胞庫，用于實驗的細胞傳代次數(shù)為3——20.高糖DMEM培養(yǎng)基（粉劑）、新生牛血清均購自美國Gibco公司。WST-1細胞增殖試劑盒購自瑞士Roche公司。
1.2實驗方法取塑料動物飲水瓶3個，按照每平方厘米內(nèi)表面積加入10ml動物飲用水的比例分別加入動物飲用水，并蓋緊瓶塞。分別采用100℃ 60min、111℃ 40min和121℃ 20min三種滅菌方式處理后，自然冷卻至室溫備用。
1.2.1細胞毒性試驗按照DMEM培養(yǎng)基（干粉）說明書的配制比例，用不同方式滅菌處理后的動物飲用水溶解培養(yǎng)基來配制細胞培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH值為7.4,用直徑為0.22μm的濾膜過濾后，加入10%新生牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?br />
1.2.2細胞形態(tài)學觀察將生長狀態(tài)良好的L-929小鼠成纖維細胞按3×104/ml的密度接種于6孔板，隨機分為4組，分別是對照組、1組（100℃ 60min組）、2組（111℃ 40min組）和3組（121℃ 20min組），每組3個平行樣。細胞在37℃、5% CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)基，溶劑對照組加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基，其余各組則加入用相應動物飲用水配制的培養(yǎng)基，置細胞培養(yǎng)箱里繼續(xù)培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)的第2、4、7天，用光學顯微鏡對每組細胞進行形態(tài)學觀察并拍照。
1.2.3測定細胞失貼壁率及細胞活性細胞分組及處理同上，在細胞培養(yǎng)的第2、4、7天，收集各組的培養(yǎng)基，同時用胰蛋白酶消化各組細胞，PBS清洗2次，加入適量新鮮培養(yǎng)基，用血球計數(shù)板在顯微鏡下進行細胞計數(shù)，分別計算失貼壁細胞數(shù)目及貼壁細胞數(shù)目，按下式計算細胞失貼壁率。細胞失貼壁率（%）=失貼壁細胞數(shù)目/（失貼壁細胞數(shù)目+貼壁細胞數(shù)目）×100%細胞按3×104/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μl,細胞分組及處理同上。在細胞培養(yǎng)的第2、4、7天，用WST-1法分析細胞活性，用酶標儀在490 nm波長下測定吸光度（OD）值，按下式計算細胞相對增殖度（RGR）。RGR（%）=實驗組組細胞OD（490）值/對照組細胞OD（490）值×100%按照RGR值將樣品的毒性反應分級如下：0級為RGR≥100;1級為75——99;2級為50——74;3級為25——49;4級為1——24;5級為0.
1.3統(tǒng)計學處理實驗計量數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件，組間比較采用完全隨機設計的單因素方差分析法，組內(nèi)差異比較采用Bonferroni法，α=0.05為檢驗水準。
2結(jié)果
2.1各組L-929細胞形態(tài)學變化光學顯微鏡下觀察結(jié)果可見對照組細胞形態(tài)正常，貼壁生長良好，呈梭形或不規(guī)則的三角形。在用不同方式滅菌處理后的動物飲用水配制的培養(yǎng)液后第2天及以后，各組細胞貼壁生長仍較為良好，但可見少量的細胞圓縮，偶見懸浮死細胞。（圖1）。
2.2各組細胞失貼壁率的變化如表1所示，添加用不同方式滅菌處理后的動物飲用水配制的培養(yǎng)液后第2天，各實驗組的細胞失貼壁率與對照組相比，差異無顯著性（χ2=1.903,P>0.05）。在第4天，各實驗組細胞失貼壁率均升高，與對照組相比差異有非常顯著性（χ2=4.262,P<0.000）。在第7天，各實驗組失貼壁率明顯升高（χ2=42.502,P<0.000），其中組3細胞失貼壁率最高，為8.24%,是對照組細胞失貼壁率的10倍以上，差異具有非常顯著性（P<0.01）。表1各組細胞失貼壁率
2.3各組L-929細胞活性的變化如表2所示，在添加用不同方式滅菌處理后的動物飲用水配制的培養(yǎng)液第2天、第4天和第7天，實驗組細胞活性明顯低于對照組，差異均具有非常顯著性（第2天，χ2=13.205,P<0.000; 第4天，χ2=17.731,P<0.000; 第7天，χ2=21.142,P<0.000）。表2各組細胞活性
2.4各組L-929細胞增殖度的變化如表3所示，在添加用不同方式滅菌處理后的動物飲用水配制的培養(yǎng)液第2天、第4天和第7天，實驗組細胞增殖度明顯低于對照組，差異均具有非常顯著性（第2天，χ2=27.172,P<0.000; 第4天，χ2=15.645,P<0.000; 第7天，χ2=11.087,P<0.000）。各組的細胞毒性分級為1級或2級。表3各組細胞增殖度
3討論
體外的細胞毒性實驗是用來評價材料對細胞生長狀況影響的方法，具有通用性，廣泛用于各種器械材料的生物相容性評價。評價的指標一般包括細胞形態(tài)學觀察、細胞貼壁狀況、細胞活性等[2].L-929細胞是Earle等[3]在1948年從小鼠皮下組織中分離出的成纖維細胞，常用于材料浸提液的細胞毒性實驗[4],并被多部國家標準和衛(wèi)生部頒發(fā)的標準推薦為評價外源性物質(zhì)細胞毒性首選的細胞[5——7].為了評價不同方式滅菌處理后的動物飲用瓶的生物安全性，選擇小鼠L-929細胞作為受試對象，用添加用不同方式滅菌處理后的動物飲用水配制的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，觀察L-929細胞的毒性反應。本研究結(jié)果顯示，不同高壓消毒方式消毒后，動物飲用水均可使L-929細胞生長形態(tài)發(fā)生一定程度的改變，細胞變圓，皺縮，細胞失貼壁率明顯上升，這些結(jié)果均提示這些高壓消毒方式均會影響動物飲水瓶的生物相容性，綜合比較幾種指標可以發(fā)現(xiàn)100℃ 60min的高壓消毒方式消毒動物飲水瓶后，動物飲用水的生物相容性與對照組接近，應為較好的高壓消毒方式。
�。ū疚牟蕡D見附頁2）
【參考文獻】
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