分析方法的驗證

分析方法的驗證，就是對藥品分析實驗所采用的分析方法是否完全達到了預期目的，或證明由分析方法誤差而導致試驗結果判斷錯誤的概率是否在允許范圍之內(nèi)，而進行的科學證明。
　　分析方法的驗證以驗證參數(shù)表示。在制定藥品質(zhì)量標準時，可通過這些參數(shù)證明所建立的分析方法是否適當。本文所述分析方法驗證是指下述情況：藥局方新收載品種質(zhì)量標準的建立；藥局方已收載品種質(zhì)量標準的修訂；根據(jù)藥局方的通則建立替代方法。

1　日本藥局方收載分析方法所需資料

1.1　概要　對分析方法作簡要說明，包括所采用分析方法的必要性，特點與優(yōu)點及有關驗證的要點。如系分析方法的修訂，則需闡明新方法與原方法的區(qū)別以及新方法的優(yōu)勢。
1.2　分析方法　本項記載的有關分析方法的內(nèi)容要足以能對分析方法進行評價，并且必要時可用復核試驗進行評價。分析方法主要記載內(nèi)容包括：分析的步驟、標準品及樣品的制備方法、試劑與試藥的調(diào)配、注意事項、分析系統(tǒng)是否正常運轉(zhuǎn)的檢驗證明方法(例如高效液相色譜法中的分離效率的研究)、分析結果的計算公式、測定次數(shù)等。并且，如果使用了藥局方以外的裝置，還需詳述有關內(nèi)容；如果使用了新的標準品，則必須提供其物理、化學及生物學特征數(shù)據(jù)，并提供其質(zhì)量標準。
1.3　有關分析方法驗證的資料　本項應包括求導各驗證參數(shù)的試驗設計、試驗數(shù)據(jù)、計算結果及檢定結果等。

2　驗證參數(shù)(validationcharacterisitics)

　　分析方法適當與否可通過驗證參數(shù)進行評價，下面列舉了最典型的分析方法驗證參數(shù)的定義及其評價方法。
　　驗證參數(shù)的有關術語及定義因分析方法的應用領域不同而不同，本文所使用的術語及定義僅限于日本藥局方。評價方法項下所述內(nèi)容也僅為簡要概述。確定驗證參數(shù)的方法很多，采用何種方法沒有具體限制。但是，驗證參數(shù)的限值常因確定方法的不同而發(fā)生變化。故此，確定驗證參數(shù)的實驗方法、實驗數(shù)據(jù)、計算方法等應盡可能詳細地記述。
　　本文分析方法驗證中未包括驗證參數(shù)適應性/牢固性(Robustness)的討論，這是由于牢固性的研究主要在分析方法的開發(fā)設計階段進行，其研究結果可以在方法的分析條件或注意事項中得到體現(xiàn)。
2.1　真度/準確度(Accuracy/Trueness)
2.1.1　定義：所謂準確度，指分析方法所得測定值的偏離程度，通常以測定值的總平均值與真值之間的差來表示。
2.1.2　評價方法：準確度一般以測定室內(nèi)重現(xiàn)精度或室間再現(xiàn)精度時所得總平均值與真值的差表示。真值一般使用理論值(如滴定法)，如果理論值不存在或即使存在但很難求出的情況下，可采用經(jīng)過確證或認可的數(shù)值來代替(如制劑分析常以原料藥的測定值作為真值)。分析方法的專屬性強，可以推斷其分析方法的誤差就小。由推出的真值與室內(nèi)(室間)再現(xiàn)精度的標準偏差即可計算出真值的95%置信區(qū)間，并可判斷這個區(qū)間是否包括0點，或區(qū)間的上下限值是否在分析方法所要求的精度范圍之內(nèi)。
2.2　精密度(Precision)
2.2.1　定義：精密度是指從均勻樣品中抽取的復數(shù)個供試品進行重復分析測定時，所得到的一系列測定數(shù)據(jù)彼此之間的一致程度。測定值的誤差以偏差、標準偏差、或相對標準偏差的形式表示。精度根據(jù)重復實驗的條件不同以三個水平表示，分別稱為：并行精度、室內(nèi)再現(xiàn)精度、室間再現(xiàn)精度。
　　并行精度(Repeatability/Intra-assayprecision)：指實驗室、實驗者、實驗日期、裝置、器具以及試藥的批號等實驗條件均未改變的情況下，從均勻樣品中抽取的復數(shù)個供試品短時間內(nèi)進行重復分析測定時(并行條件)的精度。
　　室內(nèi)再現(xiàn)精度(Intermediateprecision)：指同一實驗室內(nèi)，實驗者、實驗日期、裝置、器具以及試藥的批號等實驗條件一部分或全部改變的情況下，從均勻樣品中抽取的復數(shù)個供試品進行重復分析測定時(室內(nèi)再現(xiàn)條件)的精度。
　　室間再現(xiàn)精度(Reproducibility)：指在不同實驗室間，從均勻樣品中抽取的多個供試品進行重復分析測定時(室間再現(xiàn)條件)的精度。
2.2.2　評價方法：首先，要保證精度研究所用樣品的數(shù)量和均勻性。溶液應為均勻性樣品，在得不到均勻性樣品時，通常將大量制劑粉碎混合至認為均勻或制劑的各組分混合至認為均勻的樣品作為均勻性樣品使用。如果同時做兩個水平以上的精度評價時，可以采用諸如單因素方差分析等實驗方法，但為了正確得出分析方法的精度，必須有足夠的實驗次數(shù)、分析條件的水平數(shù)及實驗室數(shù)。并且要對可預想到的致使分析發(fā)生變化的要因進行研究。各水平的精度以偏差、標準偏差、相對標準偏差、偏差的90%置信區(qū)間以及與其相對應的標準偏差的區(qū)間來表示。將其與分析方法所要求精度的標準值進行對照，以確定分析方法是否可行。通常是以室內(nèi)(間)的再現(xiàn)精度作為方法取舍的依據(jù)。
2.3　專屬性/特異性(Specificity)
2.3.1　定義：專屬性指分析樣品中有共存物質(zhì)的情況下，對被測物質(zhì)進行正確測定的能力，即表示分析方法的識別能力。如果分析方法的專屬性有個別缺陷，可以用其他方法加以補充。
2.3.2　評價方法：確證分析方法是否達到試驗目的，確實能夠?qū)Ρ粶y物質(zhì)進行鑒別或定量。例如，分析方法的專屬性可以通過比較A為僅含被測物質(zhì)樣品(陽性對照)；B為含有制劑的其他各組成成分及不純物或分解產(chǎn)物中添加被測物質(zhì)的樣品；C為不含被測物質(zhì)，僅含制劑的其他組分、不純物及分解產(chǎn)物的樣品(陰性對照)，根據(jù)A、B、C三種樣品的分析結果進行評價。如果不純物不易得到時，可以用含有不純物的樣品(如經(jīng)時發(fā)生變化的樣品)替代。
2.4　檢出限界(Detection Limit)
2.4.1　定義：檢出限界是指樣品中所含的被測物質(zhì)可被檢出的最低量或濃度。在檢出限界內(nèi)并不意味著一定就能夠進行定量。
2.4.2　評價方法：通常以消費者危險率及生產(chǎn)者危險率在5%以下來規(guī)定檢出限界。檢出限界可以通過空白樣品或檢出限界附近的樣品測定值的標準偏差以及檢出限界附近的標準曲線的斜率算出。例如，根據(jù)檢出限界附近的標準曲線的斜率以及空白樣品測定值的標準偏差，由下式求出檢出限界。
　　DL=3.3σ/slope
　　DL：檢出限界
　　σ：空白樣品測定值的標準偏差
　　slope：檢出限界附近標準曲線的斜率
　　應用色譜法時，測定值的標準偏差可以用信噪比代替。分析方法的檢出限界應比質(zhì)量標準中規(guī)定值要小。
2.5　定量限界(Quantitation Limit)
2.5.1　定義：定量限界是指樣品中所含的被測物質(zhì)可被進行定量的最小量或最低濃度。定量限界所述樣品測定值的精度，以相對標準偏差表示，一般為10%。
2.5.2　評價方法：通常定量限界可以通過空白樣品或被測物定量限界附近的樣品測定值的標準偏差以及定量限界附近的標準曲線的斜率算出。例如，根據(jù)定量限界附近的標準曲線的斜率以及空白樣品測定值的標準偏差，由下式求出定量限界。
　　DL=10σ/slope
　　DL：定量限界
　　σ：空白樣品測定值的標準偏差
　　slope：定量限界附近標準曲線的斜率
　　應用色譜法時，測定值的標準偏差可以用信噪比代替。分析方法的定量限界應比質(zhì)量標準中規(guī)定值要小。
2.6　線性關系
2.6.1　定義：線性關系是指分析方法能夠得到與被測物質(zhì)的量或濃度具有直線關系的測定值的能力，必要時，被測物質(zhì)的量或濃度的測定值也可以是從數(shù)學公式中得到的變換值。
2.6.2　評價方法：準備一系列不同濃度(量)的被測樣品，按照分析方法的操作步驟進行測定，用測定值得到的回歸方程及相關系數(shù)對線性關系進行評價。必要時，將測定值由回歸方程算出的殘差對被測物質(zhì)的量(濃度)作圖，不應具有某種特定的趨勢。通常，采用5個不同量(濃度)的樣品作線性關系的研究。
2.7　范圍(Range)
2.7.1　定義：分析方法驗證中所述范圍是指具有一定精度和準確度的被測物質(zhì)上限及下限量(濃度)之間的領域。對于上述具有線性關系的分析方法則指：具有一定精度和準確度，并且使線性關系成立的被測物質(zhì)上下限量(濃度)之間的領域。
2.7.2　評價方法：分析方法驗證的范圍一般為標準中規(guī)定值的±20%左右，對范圍的上下限值及范圍中央值附近的樣品進行精度、真度及線性的研究討論。

3　試驗分析方法的分類

　　根據(jù)試驗目的，試驗方法主要可以分為以下3種類型，各類型分析試驗方法的驗證所要求的驗證參數(shù)見表1。應該指出，這僅是一個原則，評價分析方法所必需的驗證參數(shù)將隨分析方法的特點及試驗目的而改變。

表1　試驗類型與所要求的驗證參數(shù)

驗證參數(shù) 類型Ⅰ 類型Ⅱ 類型Ⅲ 定量試驗 限度試驗 準確度 - + - + 精密度 并行精度 - + - + 室內(nèi)再現(xiàn)精度 - -* - -* 室間再現(xiàn)精度 - +* - +* 專屬性 + + + + 檢出限界 - - + - 定量限界 - + - - 直線性 - + - + 范圍 - + - + 　　注：-：一般不需要；+：需要；*：視情況而定。室內(nèi)或室間再現(xiàn)精度選擇其一進行評價，日本藥局方通常選擇后者進行評價。

　　類型Ⅰ需做鑒別試驗，即對藥品中的主要成分及其特征進行鑒別。類型Ⅱ需做檢查試驗，即對藥品中的雜質(zhì)或不純物的量進行測定。類型Ⅲ需做含量測定和溶出度試驗，即對藥品中的成分進行測定(成分包括穩(wěn)定劑、添加劑等)和藥品有效性試驗。

4　分析方法驗證用語

4.1　適應性/牢固性(Robustness)　指故意將分析條件在小范圍內(nèi)變化時，測定值不受影響的能力。例如，反應的pH值、溫度、室間及試藥的量等分析條件在適當?shù)姆秶鷥?nèi)改變時，對測定值的穩(wěn)定性進行研究討論。測定值對于分析條件不穩(wěn)定時，應對方法加以改進。適應性的研究結果在分析方法中以表示分析條件的有效數(shù)字或注意事項的形式得以體現(xiàn)。
4.2　實驗室　指試驗進行的場所、設施。分析方法驗證中所述改變實驗室是指試驗者、裝置以及試藥的批號等試驗條件發(fā)生變化。
4.3　試驗法　指藥局方中的試驗方法，例如鑒別試驗、檢查試驗等。試驗方法應包括樣品的制備、規(guī)定值、分析方法等。
4.4　生產(chǎn)者危險率　指合格的制品由于試驗原因而錯判為不合格制品的發(fā)生概率。一般以α表示，也叫第一過失率，也就是在限度試驗中所說的假陽性率。
4.5　消費者危險率　指不合格的制品由于試驗原因而錯判為合格制品的發(fā)生概率。一般以β表示，也叫第二過失率，也就是在限度試驗中所說的假陰性率。
4.6　測定次數(shù)　指分析方法操作程序中規(guī)定的次數(shù)，為了提高分析方法的精度，有些試驗明確規(guī)定試驗次數(shù)在2次以上，分析方法驗證是對包括分析方法所規(guī)定的測定次數(shù)在內(nèi)的分析方法的評價。它與為了提高分析方法的精度進行重復分析時的重復次數(shù)不同。
4.7　測定值　一次分析所得到的一個數(shù)值。

本文譯自第13版日本藥局方附錄參考資料3所載內(nèi)容。

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