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多通道抗凝血藥物篩選檢測儀的研制
摘要：介紹一種以透射比濁法為設(shè)計原理，單片機(jī)89C52為核心的96通道高速抗凝血藥物篩選平臺。該儀器自動完成血液（血漿）凝血時間的實(shí)時檢測及數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)采集的精度、速度及靈敏度較傳統(tǒng)的凝血時間測量儀器有較大的提高。提出了將凝血時間測量用于相關(guān)藥物篩選的新途徑。關(guān)鍵詞：檢測儀 單片機(jī) 凝血時間 藥物篩選
血液凝固的過程非常復(fù)雜的。生物體在正常生理狀態(tài)下，血液中的凝血系統(tǒng)與抗凝血系統(tǒng)處于自我調(diào)節(jié)的一種平衡狀態(tài)，如果這種平衡被破壞，就會形成凝血系統(tǒng)疾病�，F(xiàn)在臨床上最常用的抗凝血類藥物是肝素，這種藥物雖然有很好的抗凝血效果，卻伴隨著血和血小板減少等副作用，而且當(dāng)患者本身患有彌散性血管內(nèi)凝血等疾病時便無法采用。現(xiàn)有的口服類抗凝血藥物（如節(jié)丙酮香豆素[1]）的使用效果又不甚理想。因此，新型抗凝血藥物的研制工作是非常必要的。
進(jìn)行抗凝血藥物開發(fā)的第一步就是要檢驗(yàn)藥物的抗凝效果，也就是凝血時間的檢測�，F(xiàn)在際上普通認(rèn)可的測量凝血時間的指標(biāo)主要有兩個：凝血酶原時間（Prothrombin Time,PT）和活化部分凝血活酶時間（Actived Partial Thromboplastin Time,APTT）。這兩個指標(biāo)是由國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會（ICSH）、估計血檢與止血委員會（ICTH）和美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）聯(lián)合制定分布的[2]。PT和APTT不僅能取代傳統(tǒng)的Duke法出血時間和玻片法凝血時間而作為新的臨床止血功能指標(biāo)，并且能為抗凝血藥物開發(fā)過程提供更好的監(jiān)控指標(biāo)。
正常的凝血過程時間很短，即使加入抗凝劑，也不會超過1分鐘。正常情況下，PT不會超過20秒，這給手工測量帶來了很大的困難。為了尋求方便的檢測途徑，(范文先生網(wǎng)www.gymyzhishaji.com收集整理)國內(nèi)外許多企業(yè)已經(jīng)開始研制相關(guān)的自動化凝血時間測量儀，并且已經(jīng)投放市場如德國TECO公司的TEChrom IV plus 4通道半自動血栓/止血測定儀；法國BIOCHEM公司STAGO全自動血栓/止血分析儀等。這些凝血測量儀雖然可以完成一個或幾個樣品的同時檢測，但是仍然沿用臨床檢測的套路，檢測速度有限，樣品用量比較大，樣品波大都固定于儀器上，清洗不方便，同時價格也相當(dāng)昂貴，不適用于藥物開發(fā)。
為了提高凝血測量儀的性能，同時滿足高通量的藥物篩選的需求，我們利用單片機(jī)設(shè)計了一套新型的凝血時間自動檢測儀，目的在于為新藥開發(fā)質(zhì)量控制提供便利。這臺小型的凝血時間測量裝置（體積僅30cm×20cm×12cm）不僅能夠進(jìn)行96路并行實(shí)時檢測，而且樣品用量少（20μl），靈敏度高（0.1秒），具有很好的應(yīng)用前景。
1 測量原理
血液的凝固從物理上來講就是非溶性纖維蛋白形成的過程，而且在很短的時間內(nèi)非溶性纖維蛋白的數(shù)量會陡然增加。這樣，整個血液的透光率就會迅速降低（濁度升高），一段時間后就會漸漸變緩。通常我們所測量的凝血時間也就是指非溶性纖維蛋白形成的起始階段，即濁度變化達(dá)到三倍信澡比的時間。
透射比濁法正是利用了血液在凝血過程中濁度突然升高的原理來設(shè)計的。只要檢測器件具有足夠的靈敏度，就可以檢測出血液凝固的時間。
2 檢測儀設(shè)計
2.1 樣品池設(shè)計
檢測儀采用標(biāo)準(zhǔn)平底透明96孔板作為樣品池，其上、下方分別為一一對應(yīng)光敏二極管和發(fā)光二極管，樣品池采用抽屜式結(jié)構(gòu)。每次使用可以將抽屜拉出，放上96孔板，再加入凝血試劑和血液（血漿），然后啟動檢測開關(guān)，開始數(shù)據(jù)采集。
2.2 電路設(shè)計
由于通過光敏二極管接收到的電壓信號變化量往往比較低（幾個mV），對于光源手檢測器件的選擇至關(guān)重要的。因此，在儀器設(shè)計以前，首先選用了幾個不同的發(fā)光二極管（以下簡稱LED）和與其對應(yīng)的光敏二極管對凝血過程透光率進(jìn)行了實(shí)測相應(yīng)的理論計算。
圖1所示為光敏二極管的基本電路。二極管兩端的電流為：
式中，I為通過不敏二極管的電流，Is為反向飽和電流，VD為二極管兩端電壓，VT=kT/q稱為混度進(jìn)行當(dāng)量，其中k為玻爾茲曼常數(shù)，T為熱力學(xué)溫度，q為電子的電量。在300K時，VT≈26mV。反向偏置時，只要|VD|大于VT幾倍以上，I=-Is，其中負(fù)號表示反向電流。
實(shí)驗(yàn)證明，光敏二極管的反向電流在一定范圍內(nèi)與LED上的加載電壓存在正比的函數(shù)關(guān)系，如圖2所示。這是因?yàn)長ED正常發(fā)光過程中，LED加載電壓與輸出光強(qiáng)存在正比關(guān)系；光敏二極管的反向電流與其吸收光強(qiáng)也存在正比的函數(shù)關(guān)系。根據(jù)這一點(diǎn)我們可以做如下推斷：
假設(shè)通過光敏二極管的吸收光強(qiáng)為φ，則
I=-Is=Cφ+m≈Cφ
其中，C與m為僅隨溫度而變化的因子，m≈0。
與光敏二極管串聯(lián)的電阻R兩端電壓V=IR=CφR，并有：φ=φ0+Δφ，V=V0+ΔV,V0=CRφ0, ΔV=CRΔφ。其中，V0和φ0為凝血反應(yīng)開始之前R電阻兩端的電壓與光敏二極管的吸收光強(qiáng)。
在凝血反應(yīng)開始之后的某一時刻，吸收光強(qiáng)為φ=φ0(1-ε)，ε為某一時刻光強(qiáng)變化的百分比，則Δφ=φ-φΔ0=-εφ0,所以
ΔV=-εCφ0R=-εV0 ΔV/V0=-ε
可以看到，電阻R兩端的電壓變化僅與ε和V0有關(guān)。ε對于固定時刻和固定的反應(yīng)體系來說是不變的，因此，ΔV僅與V0有關(guān)。也就是說，在某一確定的時刻，信號電壓變化的百分比只與反應(yīng)體系有關(guān)。根據(jù)這個結(jié)論，我們只要通過選擇合適的元器件并加以調(diào)節(jié)，提高初始輸入電壓V0，就可保證ΔV足夠大。
在設(shè)計過程中，我們選擇光強(qiáng)高、波長適宜、直徑為5mm的藍(lán)色高亮發(fā)光二極管陣列作為光源，并連接可調(diào)節(jié)電源來同時控制所有發(fā)光二極管的亮度；選擇相應(yīng)的直徑為5mm的光敏二極管陣列作為檢測元件，串連50k電位器用于逐個調(diào)節(jié)每個二極管的初始輸出電壓，消除每對發(fā)光二極管和光敏二極管之間存在的個體差異；最后選擇高精度A/D轉(zhuǎn)換器來采集數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)測量顯示，當(dāng)溶液總體積不低于60μl時，采用16位的A/D轉(zhuǎn)換器便可滿足測量精度的要求。
圖3與基本結(jié)構(gòu)的原理圖。整個儀器以Atmel公司的AT89C52（以下稱間C52）單片機(jī)為核心實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)采集和控制，配合電-光-電轉(zhuǎn)換電路的A/D轉(zhuǎn)換器（ADC）等來檢測樣品的透光率及其變化。A/D轉(zhuǎn)換器采用Analog Devices公司的16位ADC——AD7660，儀器分辨率達(dá)到2 16，大致相當(dāng)于一個4位半萬用表的精度；ADC的量程是0～2.5V。
單片機(jī)設(shè)置完成D/A轉(zhuǎn)換器（MAX7224KCWN，8-bitDAC，Maxim Integrated Products）后，光敏二極管串聯(lián)電位器上的電壓數(shù)據(jù)通過多路模擬開關(guān)（MAX306CWI，16-Channel,Maxim Integrated Products）選擇后送到ADC進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)被C52讀取。C52發(fā)出的數(shù)據(jù)再經(jīng)MAXRS232（MAXRS232CWE，Maxim Integrated Products）進(jìn)行電平轉(zhuǎn)換，通過串口傳入計算機(jī)。
2.4 軟件設(shè)計
編程采用微軟公司的Microsoft Visual Basic 6.0，功能實(shí)現(xiàn)包括以下四個主要部分：
（1）串口測試 使用前對連接串口進(jìn)行測試，工作正常則數(shù)據(jù)碼管顯示閃爍0。
（2）初始電壓檢查 檢查所有發(fā)光二極管和光敏二極管是否正常工作。為了讓所有并行孔的初始電壓盡可能接近，可以調(diào)節(jié)每個光敏二極管的對應(yīng)串聯(lián)電位器，這時數(shù)碼管顯示相應(yīng)電壓值（V）。
（3）設(shè)計檢測通道 可以任意選擇幾個通道進(jìn)行檢測，同時確定檢測時間。儀器還帶有檢測電源及外接通道的功能，正常運(yùn)轉(zhuǎn)情況下不用調(diào)節(jié)。
（4）實(shí)驗(yàn) 為了方便實(shí)驗(yàn)人員，實(shí)驗(yàn)的開始時間采用點(diǎn)動開關(guān)控制。數(shù)碼管顯示時間。實(shí)驗(yàn)過程中可實(shí)時顯示任意四個通道的數(shù)據(jù)變化。實(shí)驗(yàn)正常完成，數(shù)碼管顯示0b。數(shù)據(jù)存在csv類型文件，該文件可以用excel打開。但由于excel最多只能顯示256列，因此最多只能顯示85個通道數(shù)據(jù)。這個問題可以通過excel導(dǎo)入csv文件數(shù)據(jù)解決，結(jié)果分成兩個文件顯示。
3 儀器參數(shù)及測量方法
開啟光源之后需要預(yù)熱20分種，待光源和溫度穩(wěn)定以后再開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的溫度控制由處于抽屜底部的熱敏傳感器來完成。由于整個檢測儀有較高的電流通過，在開啟預(yù)熱過程中溫度很容易超過37℃，因此我們沒有采用常用的加熱式和水浴式控溫電路，而是采用多個風(fēng)扇來控制較小空間內(nèi)的溫度升高。
抗凝血藥物篩選檢測儀的采集速率為1000個數(shù)據(jù)/秒，因此如果96路同時檢測，時間精度為0.1秒。因此當(dāng)測量通道少于96路，時間精度會進(jìn)一步提高。實(shí)驗(yàn)檢測樣本體積必須大于或等于20μl，總體積大于等于60μl。
在不加任何試劑的情況下開啟儀器采集數(shù)據(jù)，理論上每個通道采集到的電壓數(shù)據(jù)應(yīng)該保持不變，實(shí)際上可以得到由于各種干擾引起的系統(tǒng)誤差，多次重復(fù)得到系統(tǒng)誤差為2mV。根據(jù)臨床上的通常算法，以偏離基準(zhǔn)電壓三倍系統(tǒng)誤差的時間作為反應(yīng)起始時間，即凝血時間。溶液濁度增高，在光敏二極管上反映為電壓的下降。當(dāng)測量數(shù)據(jù)的電壓值低于基準(zhǔn)值6mV的時刻作為凝血時間，這種確定方法適用于PT和APTT。
以60μl凝血測量體系（20μl樣本+40μl凝血試劑）對儀器進(jìn)行檢測。隨機(jī)選擇六個通道進(jìn)行平行PT檢測，結(jié)果重復(fù)性良好，如表1所示。這里使用的PT試劑為Sigma公司的診斷試劑ThromboMAX with Calcium，其中1、2、3號樣本為正常新鮮血漿；4、5、6號為加入肝素作為抗凝劑的血漿。由于僅測量六路信號；PT檢測精確度提高至0.01秒。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)檢測，同一樣品在各個通道中檢測的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06，同一樣品在同一個孔中重復(fù)10位的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04。
表1 六路PT平行檢測結(jié)果
據(jù)報道，PT的正常測定值為12.4秒[2]，根據(jù)不同個體情況會有所偏差�？梢钥闯觯�1中的PT檢測結(jié)果是可靠的。通過PT時間還可算出PT比、PT活性百分比和國際標(biāo)準(zhǔn)化值INR（International Calibrated Ratio）。
設(shè)計的抗凝血藥物篩選檢測儀攜帶方便、成本較低、操作簡單、檢測速度及靈敏度高，不僅可以用于抗凝血藥物的大批量初篩，同時也可用于臨床大量血樣的凝血參數(shù)測定。這是我們所知到目前為止將凝血時間測量用于相關(guān)藥物篩選的首次報道。
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